细胞工程-动物细胞工程课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物细胞工程,专题,2,细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,动物体细胞,核移植技术和克隆动物,1,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,2,一、动物细胞培养,二、核移植技术,本节内容：,3,一、动物细胞培养的应用和概念,1,、概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的,组织,将它分散成,单个细胞,然后,放在适宜的,培养基,中,让这些,细胞生长和增殖,。,2,、原理：,细胞增殖,4,定义：,人们通常将动物组织,消化后,的,初次培养,称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,分散成单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养（,贴壁生长,长成,单层细胞,。有,接触抑制,现象）,。,原代培养,3,、过程,图示,原代培养,5,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：,在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：,表面光滑、无毒、易于贴附。,6,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,7,定义：,当原代培养的细胞处于,接触抑制后,用,胰蛋白酶,处理,使细胞从瓶壁上,脱离,下来,然后加入新的培养液,将,细胞分离稀释,并,从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称,传代培养,.,（,分瓶培养的过程,）,传代培养,8,细胞株：传代细胞一般能传到,40-50,代，,遗传物质一般不会发生改变,，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（,了解即可，老课本体系,）,细胞系：传代,50,代以后不能再传下去，部分细胞,遗传物质发生了改变,，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,9,3,、总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,剪碎用胰蛋白酶处理,10,代细胞,转入培养瓶,40-50,代细胞,传代培养,无限传代,分散成单个细胞,加培养液稀释,传代,10,代以内，,遗传物质不改变，保持,正常,二倍体核型,。,传代,10-50,代左右，增长缓慢以至于完全停止，,部分细胞核型可能发生变化,（遗传物质可能改变,）,为什么用胰蛋白酶处理？,分瓶,培养,原代培养特点：,细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞,获得不死性,，,细胞突变,，,遗传物质已经改变,，,等同于癌细胞,。,细胞株：,一般说遗传物质未改变,细胞系：,遗传物质已改变,原代培养,10,4.,动物细胞培养的条件,:,1,）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：,人和哺乳动物细胞最适温度为,36.5,0.5,。,适宜的酸碱度：,PH,：,7.2-7.4,液体合成培养基：,糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素,等；通常还需加入,血浆、血清等,天然成分。,4,）气体环境：,2,）营养：,3,）温度和,pH,：,“95,空气,+5,CO,2,”,的混合气体培养箱。,氧,气是细胞代谢必须的；,CO,2,维持培养液的,PH,。,对培养液和所有培养用具,无菌处理；,培养液中,添加抗生素,防止培养过程中污染；,定期更换培养液,以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,11,问题,3,：为什么用胰蛋白酶处理？,问题,1,、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官、组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题,2,、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，,胰,蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和,细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题,4,：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适,PH,值为,7.2-7.4,，胰蛋白酶作用的适宜,PH,为,7.2-8.4,，胃蛋白酶适宜,PH,为,2,，胃蛋白酶在,PH,为,7.2-7.4,的动物细胞培养中无活性。,问题,5,：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,12,问题,6,、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题,7,、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：,1,、液体培养基,2,、成分中有动物血清等。,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。,问题,8,、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题,9,、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在,10,代以内，为什么？,10,代以内的细胞,遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,13,5,、动物细胞培养技术的应用,:,1,、蛋白质生物制品的生产,如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体,2,、应用于基因工程,主要用于作为受体细胞,3,、检测有毒物质，判断某种物质的毒性,4,、细胞的生理、药理、病理研究,如用于筛选抗癌药物,14,植物组织培养和动物细胞培养的比较：,比较项目,植物组织培养,动物细胞培养,原理,细胞的全能性,细胞增殖,培养基性质,固体培养基,液体培养基,培养基特有成分,蔗糖、植物激素,葡萄糖 促,-,动物血清,培养结果,植物体,细胞株、细胞系,培养目的,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,取材,植物幼嫩部分或花药,胚胎或幼龄动物的器官或组织,其他条件,无菌无毒，适宜条件,无菌无毒，适宜条件,15,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1,、定义：,动物核移植是将动物的,一个细胞的细胞核,移入一个已经,去掉细胞核的卵母细胞中,，使其重组并发育成一个,新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为,动物个体,。,3,、分类：,胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2,、原理：,动物细胞核具有全能性,16,4,、体细胞核移植过程,示动物克隆,无性繁殖,1,）克隆羊多利培育过程：,黑面绵羊去核卵母细胞,白面绵羊乳腺细胞核,细胞核移植,重组细胞,电脉冲刺激,早期重组胚胎,胚胎移植,另一头绵羊的子宫,妊娠、出生,克隆羊多利,特别注意：,克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！,因为：,一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体,DNA,）来自于受体卵母细胞。,二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕,受体,17,黑面绵羊去核卵母细胞,白面绵羊乳腺细胞核,a,重组细胞,电脉冲刺激,早期重组胚胎,b,另一头绵羊的子宫,妊娠、出生,克隆羊多利,1,、写出,ab,所代表细胞工程名称：,a,表示：,b,表示,:,2,、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：,体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,3,、多利面部毛色是：,根据遗传学原理说明判断依据。,4,、若黑面绵羊的基因型为,AA,白面绵羊的基因型为,aa,，则克隆羊的基因型为,核移植,胚胎移植,白色,多利全部的核基因都来自白面绵羊,aa,18,取供体细胞传代培养,10,代以内的细胞,.,为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（,M,中期,）为什么？,激活方法：,激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2,）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.,体积大，易操作。,2.,含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,19,核移植流程,:,1,、供体细胞的采集与培养,5,、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。,6,、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。,4,、将供体细胞注入去核卵母细胞,3,、显微操作去除卵母细胞中的核,2,、受体卵母细胞的采集与体外培养,7,、胚胎移植入代孕母牛体内,8,、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。,20,4,、体细胞核移植技术的应用前景,21,广而告之：,你还在为身体有残疾而苦恼吗？你还在为器官移植找不到合适的工体而焦虑吗？你能再这样下去了，看看我们的,体细胞核移植技术,吧，只需要从你身上取出一个小小的,体细胞,，通过,核移植,培养出,胚胎干细胞,，再用胚胎干细胞,诱导分化,出各种,组织器官,，这样的器官的,组织相容性抗原,跟你的一模一样，用这样的器官进行器官移植，根本,不会发生免疫排斥,。不夸张的说，如果这项技术研究成熟了，以后大家换条胳膊换条腿就跟给汽车换个轮胎一样。你听明白了吗？这不是天方夜谭，巨大的前景就在眼前，你还在等什么呢？赶紧加入到生命科学的研究中来吧！,22,23,5.,体细胞核移植技术存在的问题,看书,P49-50,页,24,动物细胞融合与,单克隆抗体,25,动物细胞融合,回忆已学知识，你是否已经见到过动物细胞融合的实例？,人鼠细胞融合实验,26,1,、定义：,也称细胞杂交，是指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。,一、动物细胞融合,杂交细胞：,融合后形成的具有原来,两个或多个细胞遗传信息,的,单核细胞,成为杂交细胞,。,27,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为,同核体。,来自不同基因型的杂交细胞则称为,异核体。,同种细胞在培养时,2,个靠在一起的细胞自发合并，称,自发融合,；,异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称,诱发融合。,28,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,29,动物细胞融合,30,2,、,诱导融合的因素,生物法：,灭活的病毒,诱导融合,.(,利用,灭活仙台病毒,是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外壳与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些,糖蛋白,可能还有促进细胞融合的功能。,),化学法：,聚乙二醇,(PEG),诱导融合,.,物理法：,电激,融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,31,思考讨论：,为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂,质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭,活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,32,3,、动物细胞融合技术的应用,细胞融合技术突破了,有性杂交,的局限，使,远缘杂交,成为可能。,利用,杂交瘤技术，,制备,单克隆抗体。,33,植物体细胞杂交,动物细胞融合,理论基础,融合前处理,诱导方法,结果,应用,相同点,制备单克隆抗体,培育新品种,杂交细胞,杂交植株,突破了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离,电激、振动、离心、聚乙二醇,纤维素酶、果胶酶,胰蛋白酶,(,或胶原蛋白酶）,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,细胞的全能性,电激、,灭活的病毒,、聚乙二醇,融合的原理相同，诱导方法相似,植物细胞杂交与动物细胞融合的比较,34,人们获得抗体的传统方法是,?,将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体,这种方法的缺点是什么,?,效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。,能否用单个,B,淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？,B,淋巴细胞在体外不能无限增殖。,二：动物细胞融合的成功应用,单克隆抗体的制备,思考,35,抗原,吞噬细胞摄取处理,T,细胞,暴露、呈递,B,细胞,直接刺激,浆细胞,增殖、分化,抗体,产生,从动物血清中分离,淋巴因子,获取抗体的传统方法,该方法的缺点是？,36,传统获得抗体方法的缺点：,产量低，纯度低，特异性差,如何获得大量的、特异性强的抗体？,利用动物细胞培养技术,克隆单一的经免疫的,B,细胞,这就是,“,单克隆抗体,”,37,单克隆抗体的制备,极富创造性的方案,将能够产生特定抗体的,B,淋巴细胞,和具有无限增殖能力的,骨髓瘤细胞,融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种,单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。,米尔斯坦,(,阿根廷,),和科勒,(,德国,),因此在,1984,年获诺贝尔奖。,38,1.,如何取得,B,淋巴细胞？,2.,把,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞放在一起，有几种融合方式？,3.,如何筛选出所需的细胞,?,4.,细胞培养有几种方式,?,5.,如何提取单克隆抗体？,制备过程提示,:,39,制备单克隆抗体,2.,单克隆抗体制备的原理,每一个,只分泌一种特异性抗体。,具有无限增殖的特性。,技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能,，又能产生足够数量的,。,利用,技术大量培养杂交瘤细胞。,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,动物细胞融合,动物细胞培养,大量增殖,特定抗体,40,单克隆抗体制备过程,注射特定抗原,骨髓瘤细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,体外培养,注射到小鼠腹腔,免疫的,B,淋巴细胞（浆细胞）,细胞培养,诱导融合,杂交瘤细胞,专一抗体检验,专一抗体检验阳性细胞,克隆细胞,单克隆抗体,第一次筛选,第二次筛选,41,B,M,M,BM,B,M,BB,MM,筛选,1,融合,体外培养,体内培养,注射入小鼠体内培养抗原,培养瓶中,筛选,2,小鼠,动物细胞培养,骨髓瘤细胞,单克隆抗体,抗原,免疫处理,动物细胞融合,筛选,动物细胞培养,提取,42,例：已知细胞增殖时合成,DNA,有,D,和,S,两条途径，其中,D,途径能被氨基喋呤阻断。,人淋巴细胞中有这两种,DNA,的合成途径，但一般不分裂增殖。,鼠骨髓瘤细胞中尽管没有,S,途径，但能不断分裂增殖，,将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有 种细胞。,加入氨基喋呤后，使,D,合成途径阻断，仅有,D,合成途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。,人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的,S,途径合成,DNA,而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。,如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？,5,骨髓瘤细胞,43,多孔细胞培养板,有限稀释法,将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，在,每个孔只有一个杂交瘤细胞,的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。,如何筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？,44,动物特异性免疫,分离,B,淋巴细胞（,B,）；找到骨髓瘤细胞（,G,）。注意,B,淋巴细胞是一个系列。（,B,1,B,2,B,3,-B,n,）,细胞融合,三种融合方式,:,（,BB;BG;GG,）,第一次筛选：在“,选择培养基培养,”上培养筛选,杂交瘤细胞,（只有,BG,杂交瘤细胞存活。但,BG,杂交瘤细胞也是一个系列：如,B,1,G,B,2,G-B,n,G,。而,BB,GG,在此培养基上不能存活。）,第二次筛选：在“,多孔培养板上,”培养,杂交瘤细胞系列,，,每孔只放一个杂交瘤细胞。,“克隆化培养”,每个杂交瘤细胞，并进行,“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。,选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，,体外培养,或注射到,小鼠腹腔内增殖,。,提取单克隆抗体。,1,、单抗的制备过程要点：,45,3,）、为何要进行两次筛选？,4,）、如何进行第,2,次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,第,1,次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第,2,次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,问题强化：,1,）、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2,）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与,B,细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有,B,细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,46,单克隆抗体的特点,项目,合成分泌细胞,提取途径,功能特性,生产特点,传统抗体,体内的多种,B,淋巴细胞,从血清中,种类多样，特异性差,纯度低，产量低,单克隆抗体,体外培养或移植到小鼠腹腔培养的单一杂交瘤细胞产生的细胞群,从杂交瘤细胞的培养液或小鼠腹腔的腹水中,种类单一，特异性强,纯度高，产量高,47,1,、,作为诊断试剂,：,在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有,准确、高效、简易、快速,特点,.,2,、,用于治疗疾病和运载药物,：,主要用于癌症治疗。优点：疗效高，毒副作用小。,生物导弹：,抗癌细胞的单克隆抗体,+,放射性同位素,+,化学药物或细胞毒素,。（单克隆抗体：导向作用。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,2,、单克隆抗体的优点：,特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3,、单克隆抗体的应用,48,动物细胞融合与单克隆抗体总结,一种诱导细胞融合的新方法,一种新细胞,灭活病毒,杂交瘤细胞,一个优势,单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势,49,例题,1,：,1975,年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。,(1),淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能,“,融合,”,在一起，说明细胞膜,。,(2),单克隆抗体的准确定义应为,(),A,一类特殊抗体,B,无性繁殖系,C,单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体,D,单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体,(3),杂交瘤细胞繁殖进行的是,_,分裂，其遗传性状,_,。,(4),单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原,(,病原体或癌变细胞等,),并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为,“,生物导弹,”,这是利用了,_,。,具有一定的流动性,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,50,例题,2,（,1,）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，,将抗原注射到小鼠体内，可获得,(,多选,),（）,A,T,淋巴细胞,B,效应,B,淋巴细胞,C,抗体,D,记忆细胞,（,2,）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，,正确的是,(,多选,),（）,A,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台,病毒或聚乙二醇诱导,B,融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克,隆抗体,C,体外培养时，一个,B,淋巴细胞可以产生一种抗体，但不,能无限增殖,D,单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，,优越性明显,BCD,ACD,51,已知细胞,合成,DNA,有,D,和,S,两条途径,，其中,D,途径能被,氨基嘌呤,阻断。人淋巴细胞中有这两种,DNA,的合成途径，但一般不分裂增殖。,鼠骨髓瘤细胞中尽管没有,S,途径,，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：,（,1,）试管中除融合的杂种细胞外，还有,种融合细胞。,（,2,）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出,杂种细胞，并说原理。,方法：,。,原理：,培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞,加入氨基嘌呤后,使,D,合成的途径阻断,所以仅,D,合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的,S,途径合成,DNA,而增殖,52,B,体外培养,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,足够数量的细胞群,注射到,小鼠腹腔,A,C,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,2,、该方案能达到预期效果吗？为什么？,4,、图中,B,为,_,过程，常用,_,作为诱导剂，该细胞继承,_,的遗传特性，既能,_,又能,_,。,1,、该实验方案的目的是,_,3,、,A,是从小鼠的脾脏中取得,_,该细胞能够产生,_,5,、,C,过程指细胞培养，该过程包括,_,培养和,_,培养两个阶段，其中,_,代以内的的细胞属于细胞株。,制备单克隆抗体,B,细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,例,3,：,53,1.,动物细胞工程技术的基础是：（）,A,动物细胞融合,B,胚胎移植,C,动物细胞培养,D,核移植,课堂练习,;,54,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）,A,结果是相同的,B,杂种细胞的形成过程基本相同,C,操作过程中酶的作用相同,D,诱导融合的手段相同,55,.,单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞,诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，,在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）,淋巴细胞,小鼠骨髓瘤细胞,B,淋巴细胞自身融合细胞,小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞,杂交瘤细胞,A,B,C,D,C,56,