基因诊断新版专题知识.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,基因诊断新版专题知识,基因诊断新版专题知识,第1页,疾病根本原因,:,疾病各种表型改变,是,基因改变,造成,基因诊断新版专题知识,第2页,基因诊疗,:,采取,分子生物学技术方法,来分析受检者,某一特定基因结构,(DNA,水平,),或,功效,(RNA,水平,),是否异常，以此来对对应疾病进行诊疗。,是病因诊疗。,检验基因存在、缺点或表示异常，对人体状态和疾病作出诊疗方法和过程。,基因诊疗,(Gene Diagnosis),含义,基因诊断新版专题知识,第3页,基因诊疗原理,1,、基因诊疗原理：,DNA,诊疗,-,检测相关基因结构及其表示功效是否正常。,RNA,诊疗,-,对表示产物,mRNA,质和量表 达分析。,基因诊断新版专题知识,第4页,第一节 基因诊疗技术方法,基因诊断新版专题知识,第5页,一、基因诊疗中常见分子生物学技术,核酸分子杂交,PCR,SSCP,（,PCR-SSCP,）,限制酶酶谱分析,DNA,序列测定,DNA,芯片技术,基因诊断新版专题知识,第6页,核酸分子杂交：按照碱基互补配对标准，将不一样起源序列互补单链,DNA/DNA,，,RNA/RNA,，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。,基因诊断新版专题知识,第7页,一、原位分子杂交技术,DNA,变性,:,当溶液中,DNA,分子处于高温或高,pH,值,(13),条件下,维持双螺旋在一起碱基互补对就被破坏,DNA,双链解离,成两条单链,这一过程叫,DNA,变性。,DNA,复性,:,当温度降低至适当温度或恢复,pH,值,至中性，两条裂,解单链按碱基互补配对标准重新形成双链结构,这一,过程叫,DNA,复性,又叫,DNA,杂交。,基因诊断新版专题知识,第8页,基因诊断新版专题知识,第9页,原位杂交：用核苷酸探针对特殊核苷酸次序在其原位进行,(in situ hybridization),杂交,叫原位杂交。可用 于,DNA,、,RNA,定位研究。,基因诊断新版专题知识,第10页,荧光原位杂交（,fluorescence in situ hybridization,FISH,）,基因诊断新版专题知识,第11页,印迹技术类别及应用,（一）,DNA,印迹技术,(Southern blotting),用于基因组,DNA,、重组质粒和噬菌体分析。,(,不但能够检出特异,DNA,片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因酶切图谱分析、基因突变分析等,),（二）,RNA,印迹技术,(Northern blotting),用于,RNA,定性定量分析。,（三）蛋白质印迹分析,(Western blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,基因诊断新版专题知识,第12页,Southern,印迹杂交用于基因探测基础过程,Southern,印迹杂交常见于探测,DNA,限制性内切酶图谱。经过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱改变，可判断是否发生了显著,DNA,突变。详细方法图示以下,：,基因诊断新版专题知识,第13页,组织或细胞,含已知基因重组质粒菌株,基因组,DNA,质粒,DNA,限制酶酶解及电泳分离,限制酶酶解及电泳分离,回收含已知基因,DNA,片段,转移到硝酸纤维膜或尼龙膜,标识探针,预杂交,杂交,洗膜,放射自显影,图 用,Southern,印迹杂交方法进行基因诊疗基础步骤,基因诊断新版专题知识,第14页,三种印迹技术比较,基因诊断新版专题知识,第15页,分子杂交试验,目 录,基因诊断新版专题知识,第16页,放射自显影照片,目 录,基因诊断新版专题知识,第17页,核酸分子杂交,制备样品,制备探针,杂交,检测,取得满意高特异性杂交关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件,基因诊断新版专题知识,第18页,基因诊断新版专题知识,第19页,取得满意高特异性杂交关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件。杂交双链稳定程度主要由其,Tm,值（熔解温度）决定。影响杂交双链,Tm,值原因包含以下几个方面：,1),杂交双链碱基组成。,GC,含量越高，,Tm,越高。,2),杂交双链长度。越长，,Tm,越高。,3),杂交双链碱基错配程度。错配程度越低，,Tm,越高。,4),溶液中离子强度。离子强度越高，,Tm,越高。,5),变性剂（如常见甲酰胺）影响。甲酰胺浓度越高，,Tm,越高。,基因诊断新版专题知识,第20页,在液相体系中，完全配正确核酸双链,Tm,值能够以下公式预计：,DNA/DNA,Tm(,0,C),81.5+0.41(G-C)%+16.6logM,0.63,甲酰胺,(%),600/L,DNA/RNA,Tm(,0,C),79.8+0.58(G-C)%+18.5logM+11.8(G-C)%,2,0.50,甲酰 胺,(%),820/L,RNA/RNA,Tm(,0,C),79.8+0.58(G-C)%+18.5logM+11.8(G-C)%,2,0.35,甲酰胺,(%),820/L,基因诊断新版专题知识,第21页,寡聚核苷酸,Tm(,0,C),2,（,AT,碱基对数）,4,（,GC,碱基对数）（适合用于,10,30bp,）,Tm(,0,C),81.5+0.41(G-C)%+16.6logM,600/L,（适合用于,14,70bp,）,其中,M,为单价阳离子（通常为,Na,+,）浓度,L,为杂交双链长度，以碱基对计算。这些公式适合用于,0.010.4mol/L Na,+,浓度及,30,75GC,。,在无变性剂存在条件下，最适杂交发生在比,DNA/DNA Tm,低,20,25,0,C,，比,DNA/RNA Tm,低,10,15,0,C,。,在固液体系中，杂交条件对杂交双链,Tm,值影响更为复杂，普通低于按上述公式得到计算值。,基因诊断新版专题知识,第22页,(,二,),聚合酶链式反应,（,PCR polymerase chain reaction),又叫体外基因扩增技术。,利用人工合成一对引物，,在被扩增,DNA,模板链两端,形成双链，由,DNA,聚合酶催,化一对引物之间聚合反应,。,基因诊断新版专题知识,第23页,详细过程：,变性：将双链,DNA,加热（,95,）使之变性，,DNA,双链,变成单链,退火：降低温度至,56,使引物与模板,DNA,单链结合,延伸：将温度升至,72,，在,DNA,聚合酶作用下，在引,物,3,端进行延伸，使原模板,DNA,一条链变成,两条链。,基因诊断新版专题知识,第24页,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,（,1,）、基础工作原理,目 录,基因诊断新版专题知识,第25页,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,含量能够扩充,100,万倍以上。,目 录,基因诊断新版专题知识,第26页,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,（,2,）、,PCR,体系基础组成成份,基因诊断新版专题知识,第27页,（,3,）、,PCR,基础反应步骤,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,基因诊断新版专题知识,第28页,（三）、单链构象多态性,(SSCP),分析,PCR,和单链构象多态性,(single stranded conformation polymorphism,SSCP),分析,把,PCR,后取得双股,DNA,加热变性后形成单链,DNA,，相同长度,DNA,单链因为碱基次序不一样，它们在中性聚丙烯酰胺凝胶中可有不一样构象而造成电泳速度不一样，这种现象称为单链构象多态性。,PCR,产物变性后经由,SSCP,分析，可能有效检出,DNA,次序变异。不是全部核苷酸序列改变都引发可检测单链构象改变，所以,SSCP,方法并不能判别全部突变。,基因诊断新版专题知识,第29页,PCR/,单链构象多态性分析（,SSCP,）,PCR,产物,变性,后，,经聚丙烯酰胺凝胶,电泳,，,正常基因和变异基因,迁移位置,不一样，,可,分析,确定致病基因存在。,基因诊断新版专题知识,第30页,基因诊断新版专题知识,第31页,四、限制酶酶谱分析,基因突变造成酶切位点丢失或相对位置发生改变,以此酶消化待测,DNA,和野生型对照,DNA,，经过比较二者酶切片段，长度，数量上差异就可判断待测,DNA,突变情况。,基因诊断新版专题知识,第32页,DNA,序列测定,是进行基因突变检测最直接、最准确方法。不但可确定突变部位，而且可确定突变性质。,分子克隆到,T,载体上，或直接对扩增产物进行测序。,基因诊断新版专题知识,第33页,DNA,芯片,(DNA chip),cDNA,芯片,(cDNA chip),是指将许多特定,DNA,片段或,cDNA,片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上,。,（六）,DNA,芯片技术,基因芯片,(gene chip),基因诊断新版专题知识,第34页,目 录,基因诊断新版专题知识,第35页,二、基因诊疗基础方法,基因变异致病类型：,内源基因变异,基因结构突变,点突变、插入、缺失、重排、异位、,基因扩增，,基因表示异常,mRNA,剪接异常,外源基因插入,基因诊断新版专题知识,第36页,基因突变诊疗,点突变诊疗,诊疗已知点突变（,PCR/ASO,）,ASO allele specific oligonucleotide,等位基因特异性寡核苷酸探针,突变碱基置探针中央,控制杂交条件,结果分析：,基因诊断新版专题知识,第37页,A T,C G,探针定位 正常,C T,(,纯合子,),C T C G C A,(,杂合子,),（新突变）（新突变）,基因诊断新版专题知识,第38页,诊疗未知突变,PCR/SSCP/,测序,DNA,芯片技术（大规模未知突变筛查）,N 4,n,1.28,平方,cm 16000,个寡核苷酸,基因诊断新版专题知识,第39页,2.,大片段丢失或插入诊疗,外侧确定有没有缺失及缺失片断相对大小,内侧确定缺失部位,.,基因诊断新版专题知识,第40页,多态性连锁分析,DNA,多态性,在同种生物不一样个体基因组中，常存在一些不影响基因功效,DNA,次序变异，称为,DNA,多态性（,polymorphism,）,基因诊断新版专题知识,第41页,DNA,多态性标识,限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphism,RFLP),短串联重复序列（,short tandom repeat,STR,）,单核苷酸多态性（,single nucleotide polymorphism,SNP,）,基因诊断新版专题知识,第42页,限制性片段长度多态性（,RFLP,）,DNA,酶切,Southern,杂交分析,DNAPCR,酶切电泳分析,由串联重复次序造成长度多态性,STR,含有较高信息量且轻易检测,STR,由,26,个核苷酸串联重复组成，微卫星,DNA,基因诊断新版专题知识,第43页,基因表示异常诊疗,mRNA,相对定量分析,斑点杂交,RTPCR,mRNA,绝对定量分析,RTPCR/,竞争性,PCR(50bp,标准,cDNA,已知浓度,),mRNA,长度分析,Northern,杂交,/RTPCR,产物电泳,基因诊断新版专题知识,第44页,外源,DNA,检测,核酸分子杂交,PCR,技术,许多病原体基因结构已被说明，设计基因特异性探针，或合成特异寡核苷酸引物，可直接从临床标本中检测病原体基因组核酸,(DNA,或,RNA),存在，即可早期、快速、敏感、特异地确定病原体存在。,基因诊断新版专题知识,第45页,第二节 基因诊疗应用,1,、遗传疾病,2,、感染性疾病,（,1,）病毒性感染,（,2,）细菌性感染,（,3,）寄生虫,（,4,）其它,基因诊断新版专题知识,第46页,3,、恶性肿瘤,4,、法医学中应用,（,1,）,DNA,指纹分析（,DNA fingerprinting,）,（,2,）短串联重复多态性分析,（,short tandem repeat,，,STR,）,基因诊断新版专题知识,第47页,一、遗传性疾病,Hb D Punjab,血红蛋白病,121,位,co,密码子由,GAA,突变位,CAA,，该突变造成限制酶,EcoR1,位点消失（,GAATTC,）,镰刀型红细胞贫血症：,第六位密码由,GAG,突变成,GTG,造成不能被,OxaN1,酶切,基因诊断新版专题知识,第48页,Mst,酶切位点,(GCTNAGG),5,3,正常基因,5,3,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,OxaN1,基因诊断新版专题知识,第49页,+,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组限制性酶切分析,基因诊断新版专题知识,第50页,遗传性疾病,-DMD,分子诊疗,杜氏肌营养不良症（,Duchene muscular dystrophy,DMD,）,X,染色体连锁隐性遗传,性肌肉疾病,发病率为,1/3 500个男孩，是,一个高发病率、高致残、高致死X染色,体连锁遗 传性疾病。,DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2400Kb,DMD基因突变造成抗肌萎缩蛋白dystrophin缺点,基因诊断新版专题知识,第51页,DMD,基因外显子缺失检测,基因诊断新版专题知识,第52页,二、感染性疾病基因诊疗策略,针对病原体特异核酸序列设计探针进行杂交,应用,PCR,技术扩增病原体基因保守序列,核酸杂交技术与,PCR,技术联合应用,基因诊断新版专题知识,第53页,SARS,相关冠状病毒分子诊疗,年,4,月，香港研究者,Peiris,等报,告了,50,例,SARS,病人临床表现和,病毒学研究结果证实，新冠状病毒,可能是,SARS,致病原因。,（,Lancet,361:9365),其它试验室陆续得出相同结论。,基因诊断新版专题知识,第54页,年,4,月，德国汉堡,Bernhard-,Nocht,热带医学研究所学者,Drosten,等用随机扩增技术，取得长度为,300 bp,核苷酸序列。,依据这段序列，建立了检测新冠状,病毒常规和实时定量,PCR,技术。,（,.org,on April 10,）,基因诊断新版专题知识,第55页,引物和探针,BNIoutS2-BNIoutAs,BNI-1,片段，,189 bp,BNIinS-BNIinAs,BNI-1,片段内套片段，,108bp,BNITMSARS1BNITMSARAs2,BNITMSARP(,荧光素标识探针）,产物长度：,77 bp,基因诊断新版专题知识,第56页,检测标本,痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺,泡灌洗液、血浆、粪便。,检测方法,逆转录,-,巢式,PCR,基因诊断新版专题知识,第57页,讨 论,疾病早期即可取得阳性结果（早,于血清转换期）。,特异性较高（,SARS,患者中阳性,率约为,80%,，对照中阴性率约为,98%100%,）。,现有方法敏感性较差，阴性结果,不能排除病毒感染。,基因诊断新版专题知识,第58页,讨 论,痰液中病毒,RNA,浓度极高，说明病毒从呼吸道,排放是主要传输路径。,血清中检测到极低浓度病毒,RNA,，提醒病毒,复制不但发生于呼吸道。,病人恢复晚期粪便中存在病毒,RNA,，说明粪,便可能也是一个传输路径。,鼻、咽拭子中含有病毒,RNA,显著少于痰液，,提醒不适合作为标本（有可能漏检）。,基因诊断新版专题知识,第59页,三、肿瘤基因诊疗,肿瘤是因为遗传物质（肿瘤相关,基因）发生突变而造成疾病。,肿瘤相关基因突变只是增加了,个体对肿瘤易感性,而并不一定,马上产生肿瘤，,肿瘤发生是一个多原因、多步骤,过程。,基因诊断新版专题知识,第60页,生物芯片技术,在今后肿瘤发病机制研究和肿瘤诊疗等方面将发挥越来越显著作用,基因诊断新版专题知识,第61页,检测肿瘤相关基因,癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因,检测肿瘤相关病毒基因,鼻咽癌,EB,，宫颈癌,HPV,检测肿瘤标志物基因或,mRNA,肝癌,甲胎蛋白（,AFP,）,结肠癌,癌胚抗原（,CEA,）,基因诊断新版专题知识,第62页,ras,癌基因检测,ras,基因中最常见点突变是第,12,，,13,或,61,密码子突变,检测方法：,PCR/ASO,PCR-SSCP,基因诊断新版专题知识,第63页,p53,检测,p53,基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子,130290,，其中,175,、,273,、,284,密码子突变最常见。,检测方法：,PCRSSCP,PCR,测序,PCRRFLP,基因诊断新版专题知识,第64页,Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP.The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.,p53 Target Gene Array,基因诊断新版专题知识,第65页,四、基因诊疗在法医学上应用,DNA,指纹,人类个体多样性和个性取决于基因组,DNA,核苷酸序列差异，即,DNA,多态性。其中，微卫星,DNA,和小卫星,DNA,等 是主要 多态性标志。,基因诊断新版专题知识,第66页,DNA,指纹,针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切人基因组,DNA,进行,Southren blot,杂交，能够得到大小不等杂交带，而且杂交带数目和分子量大小含有个体特异性，就像人 指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为,DNA,指纹或基因指纹。具以下特征：,（,1,）一个,DNA,指纹探针可同时检测多个位点变异，因而更能反应基因组特异性,（,2,）含有高度特异性，只有同卵双生儿女才有完全相同 指纹,（,3,）含有稳定遗传性,（,4,）,DNA,指纹图谱含有体细胞稳定性，即从同一个体中不一样组织、血液、肌肉、毛发等产生,DNA,指纹完全相同。,基因诊断新版专题知识,第67页,法医学上应用,个人识别,亲子判定,性别判定,基因诊断新版专题知识,第68页,