原位杂交.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,原位杂交技术,in situ hybridization,彭景楩,E-mail,：,pengjp,Tel:[phone],核酸,mRNA,、,DNA,蛋白质,RT-PCR,Realtime PCR,Northern blot,（,RNA,）,Southern blot,（,DNA,）,原位杂交,指纹分析,（,Finger printing,）,基因芯片,（,DNA microarray,）,ELISA,Westhern blot,免疫组化,背 景,主要内容,定义、基本概念和发展简史,原位杂交的基本原理,探针,(probe),与探针的标记物,探针标记法与探针的纯化,探针制备技术,核酸分子杂交信号的检测,地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法,原位杂交组织化学（,ISHH,）简称原位杂交,是将,分子杂交,与,组织化学,相结合的一项技术,在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列,定 义,核酸原位杂交技术,：利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统检测组织、细胞及染色体上特异,DNA,或,RNA,序列的一种技术，,一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法,杂交双方：,待测核酸序列、核酸探针,待测核酸序列：,克隆的基因片段，未克隆化的基因组,DNA,和细胞 总,RNA,。,核酸探针：,用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知,DNA,或,RNA,片段。,分为,cDNA,探针、基因组,DNA,探针、寡核苷酸探针、,RNA,探针等。,基本概念,分子杂交,(,简称杂交,hybridization),就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的,DNA(,或,RNA),片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子。,分子杂交,原位杂交,将特定标记的已知顺序核酸为探针与,细胞,或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。,是指带有某些,标记物,(,如放射性同位素,32P,，异硫氰酸荧光素等,),的特异性核酸序列片段。设法使一个核酸序列带上,32P,，那么它与靶序列互补形成的杂交双链，就会带有放射性。,探 针,核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的,DNA/DNA,，,RNA/RNA,，,RNA/DNA,，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。,原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行,杂交,叫原位杂交。可用于,DNA,、,RNA,定位研究。,反义技术,主要是引入目的基因,mRNA,的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交而阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列互补配对后，用于表达目的基因的,mRNA,量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少,DNA/RNA,核酸分子杂交,DNA,印迹技术,(Southern blotting),用于,基因组,DNA,的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（,RFLP,）等。,蛋白质的印迹分析,(Western blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,RNA,印迹技术,(Northern blotting),用于,RNA,的定性定量分析。靶核酸是,RNA,；电泳时，凝胶中加入变性剂，防止,RNA,分子形成二级结构,发展简史,1969,年，美国耶鲁大学,Gall,和,Pardue,首先创立，用,爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。,1971,年，,Jacob,创立电镜原位杂交技术检测爪,蟾卵母细胞,DNA,80,年代，原位杂交技术飞速发展,现已能检测只有数百碱基对的较小分子,DNA,和含量很低的,mRNA,当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探,针均采用,同位素,标记。,同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局,限性,1981,，,Bauman,等首先应用荧光素标记,cRNA,探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功,荧光杂交技术,。,1982,，,Shroyer,报道用,2,，,4,二硝基苯甲醛（,DNP,）标记,DNA,探针，使该,DNA,探针具有抗原性，然后用兔抗,DNP,的抗体来识别杂交后的探针，最后经,免疫过氧化物酶的方法,来定位杂交探针,上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。,发展简史,生物素标记,探针技术是,Brigat,（,1983,）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒,DNA,，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶,-,抗过氧化物酶显示系统显示病毒,DNA,在细胞中的定位。,生物素标记探针技术目前已被广泛应用,酶促生物素标记技术,发展简史,1987,年,Pezzella,用,磺基化,DNA,探针,，以单克隆抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。,优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，敏感度较高。,发展简史,1987,年，将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。,地高辛标记技术,引起科技工作者的极大兴趣。,标记,碱性磷酸酶,抗碱性磷酸酶,显色,优点：完全、方便、省时，敏感性和质量控制较好，可检测人基因组,DNA,的单拷贝基因，背景反差好。,发展简史,1991,年,Couton,建立将非放射性标记技术更新为亲和复合物标记技术 （,Affinity-complex Labelled Probes,，,ACLP,）。,发展趋势：实验室常规技术和临床日常应用的诊断技术。,发展简史,原位杂交的基本原理,以,DNA,分子复制原理为基础。,两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成,DNA-DNA,、,DNA-RNA,或,RNA-RNA,双键分子，应用带有标记的（,放射性同位素,，如,3,H,、,35,S,、,32,P,，荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）,DNA,或,RNA,片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（,RNA,或,DNA,）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的,mRNA,或,DNA,的存在并定位；,应用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或,蛋白质,的基因表达。,此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。,在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的,RNA,核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成杂交体,(Hybrids,）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的,mRNA,、,rRNA,和,tRNA,分子。,RNA,原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出,DNA,原位杂交技术。,尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的,mRNA,表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。,原位杂交的基本原理,原理：碱基互补配对原则,定义,：,在某些理化因素作用下，,DNA,双链解开,成两条单链的过程。,方法：,过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、,甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260,增高粘度下降,比旋度下降浮力密度升高,酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA,变性,(denaturation),DNA,变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA,的紫外吸收光谱,增色效应：,DNA,变性时其溶液,OD260,增高的现象。,变性引起紫外吸收值的改变,解链曲线：,如果在连续加热,DNA,的过程中以温度对,A260,值作图，所得的曲线称为解链曲线,。,热变性,Tm,：,变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链,DNA,变性一半所需要的温度称为,DNA,的解链温度，又称熔解温度,Tm),。,其大小与,G+C,含量成正比。,熔解温度,(melting temperature,Tm),Tm=,（,G+C,）,%0.41+69.3,DNA,复性,在适当条件下，变性,DNA,的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为,复性,。热变性的,DNA,经缓慢冷却后即可复性，,这一过程称为,退火,(annealing),。,减色效应,:,DNA,复性时，其溶液,OD260,降低。,DNA,复性,复性,RNA,DNA,核酸,的变性、复性和杂交,变性,（加热）,探针,杂交,（缓慢冷却）,复性,（缓慢冷却）,复性,：,在一定条件下，变性,DNA,单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有,A,260,减小（减色效应,）,DNA,的功能恢复,。,1.,核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为,0.1,0.5g,2.,核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在,50,300bp,3.,温度：适宜的复性温度是较,Tm,值低,25,。,4.,离子强度：离子强度过低，不利于复性。,5.,核酸分子的复杂性。,影响复性速度的诸多因素,(1),使用的探针不同：,RNA,原位杂交中多采用,RNA,或寡核苷酸探针，避免了应用双链,DNA,探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。,cRNA-RNA,杂交体比,DNA-DNA,、,cDNA-RNA,杂交体性能稳定，在杂交反应后可用,RNA,酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。,(2),检测的目的不同：,RNA,原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而,DNA,原位杂交主要为外源性基因检测。,(3),有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，,RNA,原位杂交能获得较好定位。,RNA,原位杂交特点,RNA,原位杂交也存在某些不足之处，为使,RNA,原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点：,(1),探针种类选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；,(2),有效制止组织和细胞内,RNA,降解；实验流程严防,RNA,酶污染,(3),杂交信号有效的放大和显色技巧；,(4),阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件需要观测,Northern,杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。,近几年来,RNA,原位杂交技术进展：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、,RNA,原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重,RNA,原位杂交中应用等。,RNA,原位杂交不足之处,探针,(probe),一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,核酸探针的长度控制在,50,300bp,基因组,DNA,探针,cDNA,探针,RNA,探针,寡核苷酸探针,核酸探针的种类（来源）,RNA,探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链,cDNA,或,cRNA,分子。,单链,cDNA,探针,：,由于,cDNA,中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链,cDNA,探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链,cDNA,探针的制备比较困难，在,RNA,原位杂交中已很少见有应用。,2.cRNA,探针：,是以,cDNA,为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链,cDNA,探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。,cRNA,与,RNA,之间形成的杂交体要比,cDNA,RNA,杂交体稳定，不受,RNA,酶的影响。杂交反应后可用,RNA,酶处理，以除去未结合的探针。,cRNA,探针的杂交饱和水平比双链,DNA,探针高出,8,倍，应用广泛。,cRNA,探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，它对,RNA,酶敏感，易受破坏。,RNA,探针,RNA,探针,3.,寡核苷酸探针：,人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。,合成的寡核苷酸探针的,缺点,是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与,mRNA,形成的杂交体不如,cRNA,RNA,杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。,高度灵敏性；,高度特异性；,标记物与探针结合，应绝对不能影响探针与模板的结合能力及结合的特异性；,当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（,Km,值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；,较高化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；,对环境无污染，对人体无损伤；,价格低廉等。,探针制备技术,-,探针的标记物,放射性同位素：,3,H,、,32,P,、,35,S,、,125,I,等。,非放射性同位素：,生物素,荧光、,地高辛素、,辣根过氧化酶、,碱性磷酸酶等。,不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等，在,RNA,原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少。,地高辛标记的,cDNA,、,RNA,和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。,标记物的检测灵敏度排序：,32,P,35,S,3,H,地高辛,/,生物素,探针制备技术,-,常用探针标记物,常用的同位素有：,35,S,、,33,P,、,32,P,和,3,H,标记分子：,35,S-UTP,35,S-dATP,35,S-dCTP,32,P-UTP,32,P-dATP,等等,放射性标记物,探针制备技术,-,32,P,：释放,-,粒子,能量高,穿透力极强,35,S,：放射性亦较强，但,-,粒子能量较低，,因此其检测灵敏度较,32,P,稍低。,3,H,：适用于细胞原位杂交。,125,I,和,131,I,：碘放射性同位素在,70,年代曾被,广泛应用于核酸探针的标记。,放射性核素标记物（灵敏度极高）,非放射性标记物,被导入某个单核苷酸而形成标记分子,如：,四甲基罗达明,-UTP,生物素,-UTP (Bio-UTP),地高辛,-dUTP (Dig-dUTP),溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子,探针制备技术,-,无放射性污染，稳定性好,半抗原：生物素、地高辛,配 体：生物素,荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明,化学发光物质,:,可以像放射性核素一样直接对,X,光胶片进行曝光。,光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。,非放射性标记物,在,RNA,原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。,探针标记法：酶反应法和化学反应法。,主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型,DNA,或,RNA,的,5,端或,3,端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。,酶反应法,探针标记方法,探针制备技术,-,体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链,RNA,探针的方法。,体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在,RNA,聚合酶的作用下，以,DNA,为模板，以含有,标记的三磷酸苷,为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。,体外转录常用噬菌体转录启动子，如大肠杆菌噬菌体,T3,、,T7,。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。,SP6,噬菌体的,RNA,聚合酶对,SP6,启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在,4,种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体,RNA,聚合酶存在的条件下，即转录成,RNA,。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的,RNA,就被标记。,体外转录法,探针标记方法,探针制备技术,-,非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。,直接标记法：即,化学反应法，是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。,这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶,RNA,丰富的细胞或组织中，,RNA,杂交对低拷贝的基因检测不理想。,间接标记法：,将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作放大。,这一类标记法已展示极好的发展前景。,探针标记方法,探针制备技术,-,酶促标记法,（一）切口平移法（,nick translation),1,、利用,DNase I,在,DNA,双链上造成单链切口,2,、利用大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,5,3,核酸外切酶活性在切口处将旧链从,5,末端逐步切除,3,、在,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合酶催化下，以互补的,DNA,单链为模板依次将,dNTP,连接到切口的,3,末端,-OH,上，合成新的,DNA,链，同时将标记的核苷酸掺入到新的,DNA,链中,Mg2+,离子,只能标记双链,DNA,，使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时,DNA,片段不太小,（二）随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链,DNA,模板结合，作为合成新链的引物，在,DNA,聚合酶的催化下，按,5,3,方向合成一新的,DNA,链，其核苷酸序列与模板,DNA,完全互补。另一单链,DNA,模板同样合成一条新的完全互补的,DNA,链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的,DNA,分子中,一般对基因组,DNA,进行标记时用这种方法的效果较好,随机引物法所具有的优点：,1,、能进行双链,DNA,、单链,DNA,或,RNA,探针的标记,2,、操作简单方便，避免因,DNaseI,处理浓度掌握不当所带来的一系列问题,3,、标记活性高，标记活性可达,108cpm/,gDNA,以上,4,、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,（三）,PCR,标记法：,将标记的核苷酸作为,PCR,反应的底物，以待标记的,DNA,为模板，经,PCR,反应，标记的核苷酸掺入到新合成的,DNA,分子中。,某些标记探针必须经纯化后方可使用。因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余,dNTP,等小分子。,为将掺入并结合到,cDNA,、,cRNA,和标记寡核苷酸与游离标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚,/,氯仿抽提法进行纯化,乙醇沉淀法的原理是：,DNA,可被乙醇沉淀，而未掺入,DNA,的,dNTP,则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。,核酸溶液中去除蛋白质的酚,/,氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制,RNA,酶的活性，而且酚能溶解,10-15%,的水，从而溶解一部分,ploy(A)RNA,。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于,RNA,提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。,探针的纯化,探针制备技术,-,1,、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀,DNA,片段，可去除,dNTP,和蛋白质,2,、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子,DNA,和小分子,dNTP,、磷酸根离子及寡核苷酸（,80bp),等物质分离，常用凝胶基质是,Sephadex G-50,3,、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,探针的纯化,探针制备技术,-,靶核酸分子,靶分子（或靶序列）：,指所要探测的核酸分子或核苷酸序列,（,DNA,或,RNA,）,DNA,可以是中期染色体上的或是间期细,胞核内的，也可以是线粒体,DNA,或,病毒,DNA,RNA,可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子,的,mRNA,，也可以是核糖体,rRNA,线粒体或病毒,RNA,放射性同位素标记探针,放射自显影,非放射性同位素标记探针,偶联反应,+,显色反应,核酸分子杂交信号的检测,Vermot J.2000.Endocrinology.,Diao HL.2007.Fertil&Steril,Xie HR et al.2007.PANS,35,S,35,S,地高辛,地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法,地高辛（,Digoxigenin,简写,Dig-,）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应；,地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（,dUTP,）上形成,Dig-11-dUTP,。通过随即引物或缺口平移法（多用随机引物法），将,Dig-11-dUTP,与探针的核酸分子相连，构成,Dig-,配基,标记的核酸探针。,采用人工方法可将地高辛的线型间隔臂与,dUTP,连接起一来形成,DIG-11-dUTP,，通过体外转录将,DIG-11-dUTP,掺入到,RNA,探针中，寡核苷酸探针的标记则是利用末端转移酶催化，在单链,3-,羟基端直接添加,DIG-11-dUTP,尾巴,，从而使地高辛掺入到序列末端,达到标记的目的。,地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法,将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交；,用偶联有酶或荧光素的羊抗地高辛抗体,Fab,（抗原结合片断）结合物作为酶标或荧光标记；,用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。,地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法,近年来，地高辛（,Digoxigonin,）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。,1987,年，地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。,地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶,-,抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。,地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组,DNA,中的单拷贝基因。,地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法,C,C,C,C,C,C,取材、切片,杂交流程,观察、照相,地高辛标记探针的显色检测,常用免疫酶学显色检测方法有两类：,Dig-HRP,检测系统，,以,DAB/H,2,O,2,为底物，结果为棕色；,以,4-,氯,-1-,萘酚,/H,2,O,2,为底物，结果为,蓝色,。,Dig-AKP,检测体系，,以,BCIP/NBT,为底物，结果为,蓝紫色,沉淀。,与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，,AKP,灵敏度和分辨率较,HRP,高约,10,倍左右，但,HRP,的优点为廉价、稳定。,差异表达基因验证,在围植入期子宫中的定位,原位杂交,Bar:80m,化学发光检测,能通过,X,光片记录下很轻微的信号,1,、使用封闭剂对杂交后的膜进行处理,以阻止抗体对膜的特异性吸引,2,、加入结合有,碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体,(Anti-DIG-AP),形成酶联抗体,-,半抗原复合物,3,、加入,化学发光底物,CSPD,或,CDP-StarTM,使其与膜上的杂交探针所结合的抗体复合物充分反应,4,、最后在,X,光片上曝光,以记录化学发光信号。,化学发光检测在尼龙膜上的效果优于在纤维素膜上的效果。,地高辛标记探针的显色检测,地高辛标记探针的显色检测,化学显色,显色原理相同，显色底物是,5-,溴,-4-,氯,-3,吲哚酚磷酸盐,(,也称,X-,磷酸盐，,BCIP,),和氮蓝四唑盐,(,NBT,),，它与酶联抗体,-,半抗原（,Anti-DIG-AP,）复合物在酶促作用下发生反应，于数分钟内开始呈现,蓝紫色,，随时间延长，颜色逐渐变深，通常于,24h,终止反应。,如用坚固红,(FR,AS-MX),产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝,(FB,AS-MX),则产物为紫绿色，而,BCIP,NBT,为紫蓝色,地高辛标记的核酸探针较稳定，根据告在,-20,储存可达,2,年，随时可以取用，不像放射性标记的探针有半衰期所致的时间限制。,现实应用中，人们仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记,36,个月以内的核酸探针。,为节省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的 杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验，对于细胞或组织内未知,mRNA,的检测，仍宜采用使用过的探针杂交液为佳。,与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。,与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。,地高辛标记,cRNA,探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，下面较详细的叙述其操作过程。,组织和器材的特殊处理,取材、固定、切片,杂交前处理,探针的制备和预杂交,杂交反应,杂交后处理,检测杂交信号，进行结果分析,地高辛标记探针原位杂交操作步骤,器材的特殊处理,DNA,：,稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的,DNA,原位杂交,RNA,：,RNA,酶,几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测,RNA,或用,RNA,作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防,器材的特殊处理,取材的器具用火焰灼烧过,标本尽早固定，固定剂可灭活部分,RNA,酶,所用玻璃器皿均须,0.1,二乙基焦碳酸盐（,DEPC,）水,浸泡（,37,，,2h,）,蒸馏水清洗，高压消毒去除,DEPC,，然后,180,处理,3h,以上,塑料器材最好用灭菌的一次性用品。,0.1,二乙基焦碳酸盐（,DEPC,）水,RNA,酶抑制剂，有毒须去除,器材的特殊处理,不适宜高温的可用新鲜配制的,DEPC,在室温处理,2,3h,，再置于,85,条件下干燥,1h,，使有毒的,DEPC,失活,所用,试剂用,DEPC,水，终浓度,0.05%-0.1%,配制,，配好后室温处理过夜或室温搅拌,20min,，然后高压消毒,所用操作都要带,手套,玻片：,热肥皂刷洗，自来水，清洁液中浸泡,24h,，,DEPC,浸泡,2h,以上，,1803h,后，以去除任何,RNA,酶。无尘存放,粘附剂,多聚赖氨酸、明胶；,玻片硅化处理：,2%,氨丙基三乙氧基硅烷（,APES,）丙酮液浸泡,3min,丙酮洗去,APES,，,DEPC,处理过的蒸馏水清洗。锡箔纸包裹无尘存放。,工作台等平时,用手接触的地方,70,酒精或,10,SDS,擦拭,器材的特殊处理,去除或抑制,RNA,酶的方法有两类,物理方法：,对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器,具作高温烘烤（,180-200,干烤,4-6,小时）,对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒,化学方法：,焦碳酸二乙酯,(DEPC),作用机制是通过与组氨酸结合而使蛋白,质变性,去除或抑制,RNA,酶方法：,取 材,总的目的,是既要充分保留被测核酸，（,特别是,RNA,）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。,基本要求,与免疫组织化学技术相似，即,组织要求新鲜,和,迅速投入固定液,。,取材过程中避免手指、唾液和未经,RNA,酶抑制,处理的器具接触标本,整个操作过程带手套和口罩。,兼顾到三个方面：,保持细胞结构,最大限度保持细胞内核酸水平，,DNA,比较稳定，固定剂的种类和浓度并不十分重要，而,RNA,容易降解，因此固定十分重要。,使探针易于进入细胞或组织,4%,多聚甲醛,2-6,小时（培养细胞,30,分钟）,常用固定剂：,多聚甲醛、,醋酸,-,酒精的混合液和,Bouin,固定剂,固 定,组织样品储存,储存：,所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用,0.1%,焦碳酸二乙酯,(DEPC),水清洗。,为防止,RNA,迅速降解，标本离体后，先切成,1.51.2cm,大小，其厚度不超过,0.2cm,，应迅速投入,4,多聚甲醛溶液内，置,4,冰箱内,2-4,小时。再将组织移入,30,蔗糖,PBS,溶液内，,4,冰箱内过夜。次日可将标本储存于,-80,低温冰箱内保存。,新鲜标本的储存,组织样品制备,组织制片,冷冻切片,以厚,530um,最佳。先将组织在,-20,恒冷切片机内停留,待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成,7m,薄片。,切片贴在预先清洁、高温处理并涂以粘附剂的载玻片上,40,烤箱内干燥切片,2,小时后储存在,-80,超低温冰箱内备用。上述处理的切片在,-20,可保存周，在,-70,可保存数月之久,石蜡包埋切片,，应脱蜡经梯度酒精脱水。一般不提倡浸入二甲苯溶液，如细胞内,mRNA,含量高时应用二甲苯脱蜡。,在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中,RNA,酶的污染，宜用锡箔纸（,foilpaper,）包被。,1,、固定小块组织于多聚甲醛中，,4,，不超过,24h,，时间段，,mRNA,损失少,2,、,PBS,洗，两次，每次,30,分钟,3,、常规脱水、透明、包埋。也可冰冻切片,4,、,切片,5-10,微米,5,、,用,0.1%DEPC,水捞片,（捞片器皿预先处理）,6,、,37,烤片,1-3,天，充分干燥。,7,、储存与,-20,，放干燥剂（使用时必须现在,37,干燥一天，以防脱落）,组织样品制备具体操作,对照实验,标本对照,已知阳性组织；已知阴性组织；或,RNA,酶或,DNA,酶预处理,探针对照,探针的,Northern,印迹或,Southern,印迹分析；同义,RNA,探针；无探针；不同浓度的未标记探针（竞争性抑制）；无关标记探针（非特异性吸附）,目的：,1,、增强组织或细胞的,通透性,，以利于探针的穿透,2,、尽可能减少与探针产生非特异吸附的背景,通透物质有两类,蛋白酶和表面活性剂：,杂交前处理,表面活性剂：,Triton X-100,SDS(,十二烷基硫酸钠,),Tween,（配成各种较低浓度与切片孵育,1-5,分钟）,蛋白酶：,蛋白酶,K,胰蛋白酶,(pepsin),胶原酶 （富含结缔组织或肝脏切片）,1,、去污剂处理,：,Triton X,100,（,0.01,0.03,）,增强通透性,2,、蛋白酶处理,：,蛋白酶,K,（胃蛋白酶、链霉蛋白酶等），注意及时终止消化（含有甘氨酸的,PBS,），,消除组织固定时产生的分子间交联对靶核酸造成的屏蔽作用；还有,增加组织通透性和去除无关的杂蛋白,的意义。,缺点是,容易造成掉片；同时也会减低,RNA,的保存量和影响组织结构的形态，在用量及孵育时间上应灵活掌握,杂交前处理,3,、稀酸处理,0.2MHCl,，使碱性蛋白变性，经蛋白酶消化后易被解除，降低背景。,4,、乙酸酐处理,使组织蛋白中的碱性基团乙酰化，防止静电结合，降低背景,5,、,内源性,生物素和酶活性的抑制剂,注意：整个处理过程防止,RNA,酶污染,杂交前处理,1,、常规脱蜡复水,2,、,0.2M HCl,室温浸泡,20,分钟,，双蒸水洗,2,分钟,3,、加入,蛋白酶,K,（,1ug/ml,），,37,，水浴,3,分钟，含,0.1M,甘氨酸的,PBS,洗,2,分钟。,4,、,4%,多聚甲醛后固定，室温,4min,，,PBS,漂洗，水洗。,5,、,0.25%,乙酸酐，,室温,15,分钟，水洗。,6,、各级乙醇脱水，干燥,注意：预处理步骤示情况而定，并非绝对必需。,杂交前处理具体操作,探针的制备,总,RNA,的提取及反转录，,RT-PCR,扩增相关基因片段，产物经电泳进行胶回收。,溶解纯化后,PCR,产物与,pGEM-T,载体分别进行连接和转化，涂平板挑选白色菌落，,37,C,过夜摇菌,以重组质粒（按,kit,说明书从菌液中提取质粒,DNA,）为模板，用,SP6,和,T7,为引物进行,PCR,扩增。,扩增产物经凝胶电泳后回收用无,RNase,水溶解，紫外分光光度仪测定其浓度,探针的制备,5.,探针标记按,RNA,标记试剂盒说明进行。用,T7 RNA,聚合酶或,SP6 RNA,聚合酶分别制备正义,cRNA,探针或反义,cRNA,探针。,0.5 mlEP,管，按顺序加入下列试剂：,PCR,产物片段,1g/13 l,10NTP,标记混合物,2 l,10,转录缓冲液,2 l,RNase,抑制剂,1 l,RNA,聚合酶,(T7/SP6)2 l,混匀后离心，于,PCR,仪上,37,C,孵育,2 h,探针的制备,6.,加入,DNase I,，,37,C,孵育,15 min,，降解模板,DNA,；,加入,LiCl,、,100%,乙醇，混匀后置,-20,过夜沉淀,RNA,，,4,C 12,000 r/min,离心,15 min,，弃上清,7.70%,乙醇（无,RNase,水配制）漂洗沉淀，,4,C,12,000 r/min,离心,2 min,，弃上清,8.,无,RNase,水溶沉淀，加入甲酰胺混匀分装后置,-80,C,储存备用,预杂交（,Prehybridization,）,预杂交,能饱和组织中能与探针结合的非特异性位点，如蛋白质、多糖等，是减低背景染色的一种有效手段。,预杂交液,不含探针,将组织切片浸入预杂交液中孵育,2h,预杂交具体操作,从,-80,C,冰箱中取出冰冻切片,50,C,展片台上热固定,4%,多聚甲醛固定,1 h,，,PBS,冲洗,3,次 玻片放置于,1%Triton-X 100,的,PBS,溶液处理,20 min,，,PBS,冲洗,3,次 甩干玻片上的水 滴加预杂交液 片子放置杂交等渗液的湿盒内，室温,15 min,。,杂交反应,杂交即指序列互补的探针与靶核酸间的配对结合。这是,原位杂交技术的关键步骤。,探针的准备,双链核酸的变性,杂交反应,探针长度,：,50,100,个碱基和碱基对最佳,探针标记物,：地高辛（,DIG,）,探针浓度,：,0.5,5.0g/ml;,杂交液,的量要适当，以,10,20l/,每张切片为宜,杂交反应,-,探针准备,理论热变性温度：,90,95,甲酰胺法：,甲酰胺可降低解链温度，常规的加入,30%,50%,甲酰胺于杂交液中，每增加,1%,的甲酰胺浓度，,Tm,值可降低,0.72,，降至,37-40,为宜。,微波炉法：,将加有杂交液的玻片加盖玻片后密封，置于微波炉内，,650W,，,50,功率,2min,，可达,105,，再以,10,功率,7min,，冰上冷却,注意：,在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。,当靶核酸或探针为,DNA,时，杂交前需要使它们变性成为单链,杂交反应,-,探针和靶核酸变性,探针,预变性的探针,高浓度盐类,（柠檬酸钠）,增加杂交体的稳定性,0.1 g,甲酰胺,-,500,l,去离子甲酰胺,甲酰胺可降低解链温度,硫酸葡聚糖,0.1 g,硫酸葡聚糖，,对,DNA,有浓缩作用，可提高杂交的反应速度,10,倍以上，但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为,5%,10%,牛血清白蛋白和鲑鱼精,DNA,或,RNA,2%,牛血清白蛋白，,用于阻止探针与非特异位点或非目标,DNA,杂交。,杂交反应,-,杂交液的组成,方法：,将,杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片,防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。,实际采用的原位杂交的温度在,Tm-25,左右，即比,Tm,减低,25,，大约在,30,60,之间,时间：,16,20,小时,，一般过夜，但不超过,24h,。,湿盒,中进行,PH,：,6.5,7.5,一般,55,C,杂交,16-18 h,；,当杂交液含,50%,甲酰胺、盐浓度,0.75mol/L,左右时，杂交温度：,对,DNA,探针是,42,对,RNA,探针是,50-55,对寡核苷酸探针是,37,杂交反应,-,温度、时间和,PH,杂交反应,-,具体操作,探针从,-80,C,冰箱取出 冰上融化,PCR,仪上,85,C,变性,3