质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒提取和限制性内切酶消化,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第1页,目,巩固质粒概念，经过原理部分学习加深对质粒,DNA,与染色体,DNA,理化性质差异认识,学习碱裂解法提取质粒,DNA,方法,掌握酶切反应操作,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第2页,质 粒 提 取,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第3页,质粒是染色体外小型（1-200,kb）,共价、闭合、环状双链,DNA,分子，能自主复制并能稳定遗传遗传因子。,是进行,DNA,重组惯用载体。,经常编码一些对宿主有利酶基因，这些基因表型主要为抗生素抗性。,质 粒,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第4页,Amp,r,抗性基因,Amp,r,抗性基因编码一个周质酶（,-,内酰胺酶）可特异地切割,Amp,-,内酰胺环，从而使其失去杀菌能力,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第5页,常 用 质 粒 提 取 方 法,煮沸法,对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒,DNA,。提取质粒,DNA,中会含有,RNA,。,碱裂解法,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第6页,碱裂解法提取原理,宿主菌线状染色体,DNA,与闭环双链质粒,DNA,结构状态差异,加入碱变性时，线状基因组,DNA,变性充分而质粒,DNA,处于拓扑缠绕自然状态而不能彼此分开,当条件恢复时（酸中和），质粒,DNA,快速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子。,因为操作原因，提取质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第7页,收菌,重悬,裂解,中和,过柱,洗涤,洗脱,质粒提取试剂盒操作步骤,P1:50mM,葡萄糖，,25mMTris-HCl,10mM EDTA pH8.0,P2:0.2MNaOH,1%SDS,P3:3M,醋酸钾,2M,醋酸,硅基质膜在高盐低,pH,值（,pH7.5,）时可结合,DNA,，在低盐及高,pH,值（,pH8,）条件下洗脱,。,75%,乙醇,对数生长后期,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第8页,取菌液,12,000rpm,离心,2min,弃上清,（尽可能吸尽上清）,用,250uLPI,重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮,加入,250uLP2,，,温和,地上下颠倒,6-10,次,(,溶液粘稠清亮,),加入,350uLN3,马上温和,上下翻转,6-10,次（白色絮状沉淀）,12,000rpm,离心,10min,小心吸收上清，加入吸附柱,12,000rpm,离心,1min,弃滤液,加入,700uL,buffer PW,12,000rpm,离心,1min,，,弃滤液,空柱,12,000rpm,离心,2min,，室温开盖放置,3 5 min,加入,500uL,buffer PW,12,000rpm,离心,1min,，,弃滤液,吸附柱置于新离心管中，加入,50-100uLbuffer EB,室温放置,2min,，,12,000rpm,离心,1min,，搜集质粒溶液到离心管，,-20,保留。,CWBIO,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第9页,取菌液,12,000rpm,离心,2min,弃上清,（尽可能吸尽上清）,用,250uLPI,重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮,加入,250uLP2,，,温和,地上下颠倒,6-10,次,(,溶液粘稠清亮,),加入,350uLP3,马上温和,上下翻转,6-10,次（白色絮状沉淀）,12,000rpm,离心,10min,小心吸收裂解上清，加入吸附柱,12,000rpm,离心,1min,弃滤液,加入,500uL,buffer PD,12,000rpm,离心,1min,，,弃滤液,空柱,12,000rpm,离心,2min,，室温开盖放置,3 5 min,加入,600uL,buffer PW,12,000rpm,离心,1min,，,弃滤液（,重复一次,）,吸附柱置于新离心管中，加入,50-100uL,洗脱液,EB,室温放置,2min,，,12,000rpm,离心,1min,，搜集质粒溶液到离心管，,-20,保留。,T&G,（,500uL,平衡液,BL,，加入吸附柱,12,000rpm,离心,1min,弃滤液）,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第10页,质粒电泳图,开环双链环状,DNA,直线,DNA,共价闭环超螺旋,DNA,质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座,第11页,