免疫组织化学的原理及应用.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,组织学与细胞学、组织化学、生物化学、,免疫组织化学,组织学、细胞学与组织化学区分：,1、组织、细胞学是研究形态结构与功效关系,2、组织化学是研究组织细胞内化学成份及其含量或酶存在及其活性,免疫组织化学的原理及应用,第1页,组织化学概念:=细胞化学,是利用物理、化学、免疫学和分子生物学等原理，对组织与细胞化学成份或酶活性进行定性、定位和定量研究科学。,传统组织化学概念：,是利用物理、化学,免疫学、电镜技术和分子生物学技术发展免疫组织化学、免疫电镜组织化学、原位杂交技术等,免疫组织化学的原理及应用,第2页,广义组织化学包含：,传统组织化学、,免疫组织化学、,电镜组织化学、,免疫电镜组织化学、,原位杂交组织化学等,免疫组织化学的原理及应用,第3页,生物化学与组织化学区分：,生物化学：,1、利用化学原理分析细胞组成成份以及这些成份在生命过程中化学反应。,2、生物化学将组织细胞制成匀浆研究（结构被破坏）,3、生物化学化学反应在试管内或容器内,4、生物化学化学反应结果观察不用显微镜,5、产物需要分离、提纯、判定。,组织化学：,利用化学反应原理在组织细胞内对组织细胞化学成份进行定性、定位和定量研究。产物多需要显色剂显示。如：利用酶特征,免疫组织化学的原理及应用,第4页,一、免疫组织化学技术基本原理：,免疫组织化学技术是利用抗原与抗体能特异性结合基本特点，经过显示剂显示,确定一些抗原或抗体有没有或其存在位置，来研究某事物特征。,免疫组织化学的原理及应用,第5页,二、组织化学与免疫组织化学技术区分,组织化学技术,：（HE 特殊染色）,经过应用一些能与组织、细胞化学成份特异性结合显色试剂，定位显示组织、细胞特殊化学成份一门技术。,优点：既保留原有形态改变又显示特殊化学成份到达形态、功效与代谢相结合。,（不敏感、特异性差）,免疫组织化学的原理及应用,第6页,二、组织化学与免疫组织化学技术区分,免疫组织化学技术,：,将抗原、抗体反应特异性与组织化学反应可见性结合在一起，形成了,免疫,组织化学技术。,优点：,1、形态、功效与代谢相结合（微量）,2、检测成份愈加广泛、敏感、特异性更强,免疫组织化学的原理及应用,第7页,三、,免疫组织化学技术发展,免疫荧光技术 抗体酶标法,多克隆抗体技术 单克隆抗体技术,ABC法、S-P法等 原位杂交及原位PCR等免疫组化法。,免疫组织化学的原理及应用,第8页,四、,免疫组织化学技术优点,1、特异性强,2、敏感性高,3、定位准确,4、形态、功效与代谢相结合,免疫组织化学的原理及应用,第9页,五、免疫组织化学方法,免疫组织化学,Immunohistochemistry,Immunocytochemistry,1、特异性抗原和特异性抗体（结合）,2、显色系统,显示剂：酶,金属原子,荧光分子,同位素分子,酶底物：DAB(3,3-二胺基联苯胺),AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑),坚牢蓝，坚牢红.,免疫组织化学的原理及应用,第10页,（一）直接法,:酶标法（一步法）,将酶（HRP）标识在特异抗体上，方法简捷,需要标识全部抗体,Ag,Ab-HRP,.底物-显色剂显色,免疫组织化学的原理及应用,第11页,免疫组织化学的原理及应用,第12页,（一）直接法,:酶标法（一步法）,将酶（HRP）标识在特异抗体上，方法简捷,需要标识全部抗体,.,.Ag,Ab-HRP,免疫组织化学的原理及应用,第13页,（一）直接法,:酶标法（一步法）,将酶（HRP）标识在特异抗体上，方法简捷,需要标识全部抗体,.,.Ag,Ab-HRP,Ag,Ab-HRP,免疫组织化学的原理及应用,第14页,（一）直接法,:酶标法（一步法）,将酶（HRP）标识在特异抗体上，方法简捷,需要标识全部抗体,.,.Ag,Ab-HRP 底物-显色剂显色,Ag,Ab-HRP,免疫组织化学的原理及应用,第15页,（一）直接法,:酶标法（一步法）,将酶（HRP）标识在特异抗体上，方法简捷,需要标识全部抗体,.,.Ag,Ab-HRP 底物-显色剂显色,Ag,Ab-HRP底物-显色剂,显色,需要标识全部抗体,免疫组织化学的原理及应用,第16页,免疫组织化学的原理及应用,第17页,（二）间接法,:二步法,将酶（HRP）标识在第二抗体上，,.Ag,Ab1,Ab2-HRP,底物-显色剂显色,二步法,应用范围广;不需标识一抗,只需标识几个种属二抗即可,免疫组织化学的原理及应用,第18页,免疫组织化学的原理及应用,第19页,（二）间接法,:二步法,将酶（HRP）标识在第二抗体上，,.Ag,Ab1,Ag,-Ab1,免疫组织化学的原理及应用,第20页,（二）间接法,:二步法,将酶（HRP）标识在第二抗体上，,.Ag,Ab1,Ab2-HRP,Ag,-Ab1-Ab2-HRP,免疫组织化学的原理及应用,第21页,（二）间接法,:二步法,将酶（HRP）标识在第二抗体上，,.Ag,Ab1,Ab2-HRP,底物-显色剂显色,Ag,-Ab1-Ab2-HRP-底物-显色剂,显色,二步法,应用范围广;不需标识一抗,只需标识几个种属二抗即可,免疫组织化学的原理及应用,第22页,免疫组织化学的原理及应用,第23页,免疫组织化学的原理及应用,第24页,Envision System,是将二抗 和 HRP 经过一个多聚葡聚,糖骨架连接成一个多聚体，多聚体中没有生物素参加，所以它不受内源性生物素影响，使背景染色降低。,特点：敏感、省时、方便、背景低,免疫组织化学的原理及应用,第25页,免疫组织化学的原理及应用,第26页,（三）三步法,:,将酶（HRP）标识在复合物上,1、PAP,法,免疫组织化学的原理及应用,第27页,免疫组织化学的原理及应用,第28页,（三）三步法,:,将酶（HRP）标识在复合物上,1、PAP,法,2、ABC法,免疫组织化学的原理及应用,第29页,免疫组织化学的原理及应用,第30页,（三）三步法,:,将酶（HRP）标识在复合物上,1、PAP,法,2、ABC法,3、S-P法,免疫组织化学的原理及应用,第31页,链霉菌抗生物素蛋白,免疫组织化学的原理及应用,第32页,抗原,一抗,二抗,生物素,酶,组织,组织,生物素,生物素,卵白素,卵白素,链霉菌抗生物素蛋白,免疫组织化学的原理及应用,第33页,4、四步法、五步法,5、,多重标识,:,在同一组织或细胞上显示两种以上抗原。,SP法,ABC法,48倍,SP法,PAP,法,2550倍,免疫组织化学的原理及应用,第34页,组织标本取材固定,一、取材：,二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、,切片、,捞片,、烤片、脱蜡、水化,三、玻片处理：防脱片胶,APES Poly-L-Lysin,免疫组织化学的原理及应用,第35页,三、防脱片处理步骤,（一）载玻片和盖玻片处理,将载玻片或培养用小盖片浸泡在重铬酸钾浓硫酸清洁液中24小时，然后流水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍以上，而后置95%乙醇中12小时。取出擦干或烤干，贮放于玻片盒内备用。,盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短时间，清洁液浸泡只需2小时，流水冲洗注意勿损伤玻片。,免疫组织化学的原理及应用,第36页,（二）黏附剂使用,1、多聚左旋赖氮酸（poly-l-lysine）,首先配制0.1%多聚左旋赖氮酸浓缩液（配方见附录一），室温下（1826）可保留1年。使用时，将试剂10倍稀释成工作液，浓度为0.01%，28冰箱保留，使用期3个月。,使用方法是将充分洗净和预先干燥玻片浸泡于稀释后多聚左旋赖氨酸深液数十秒或提拉十次，沥干，于室温下晾干1224小时或在45以下烤箱内烘干。处理后玻片避光干燥可长久保留。,免疫组织化学的原理及应用,第37页,2、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane,APES）,APES必须现用现配。用此方法黏合玻片应垂直烤片而不能水平烤片，不然，组织片中易出现气泡。,APES使用方法：用丙酮50倍稀释（APES 1份、丙酮49份混合），将洗净玻片放入稀释好APES中，停留2030秒，取出稍停，再入纯丙酮或蒸馏水中涮去未结合APES，置通风橱中晾干即可。注意用APES防脱片处理载玻片捞片时组织应一步到位，并尽可能降低气泡存在，以免影响染色结果。,注意不要将APES与其它防脱片剂混合使用。,免疫组织化学的原理及应用,第38页,多聚左旋赖氨酸为当前免疫组织化学染色中最惯用防脱片剂，适合于需要酶消化、微波、高温高压防脱片处理。,如效果不佳，可用双重处理（APES和poly-l-lysine）切片。,在以上两种方法均无效情况下，可用以下方法：切片在脱蜡前放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干后即可进行下一步骤。,对HE染色切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油。,免疫组织化学的原理及应用,第39页,组织标本取材固定,一、取材：,二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、,捞片,、烤片、脱蜡、水化,三、玻片处理：防脱片胶,APES Poly-L-Lysin,四、抗原修复,化学法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、链霉蛋白,酶、尿素等,物理法：单纯加热、高压加热、微波加热,10分钟 90120秒 10分钟,免疫组织化学的原理及应用,第40页,组 织,Ab,固定液PH值,3.0,5.0,7.0,8.0,10,抗,原,修,复,液,P,H,值,6.0,皮肤,AE,1,/AE,3,-,-,-,-,-,胃粘膜,EMA,+,+,+,+,+,子宫肌瘤,SMA,+,+,+,+,+,乳腺癌,ER,+,+,+,+,+,7.0,皮肤,AE,1,/AE,3,-,-,-,-,-,胃粘膜,EMA,+,+,+,+,+,子宫肌瘤,SMA,+,+,+,+,+,乳腺癌,ER,+,+,+,+,+,8.0,皮肤,AE,1,/AE,3,+,+,+,+,+,胃粘膜,EMA,+,+,+,+,+,子宫肌瘤,SMA,+,+,+,+,+,乳腺癌,ER,+,+,+,+,+,E,D,T,A,8.0,皮肤,AE,1,/AE,3,+,+,+,+,+,胃粘膜,EMA,+,+,+,+,+,子宫肌瘤,SMA,+,+,+,+,+,乳腺癌,ER,+,+,+,+,+,免疫组织化学的原理及应用,第41页,免疫组化染色步骤：,（一）S-P法染色步骤:,1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4),冲洗三次,每次三分钟（3,3,）。,2、依据每一个抗体要求，对组织进行对应,修复。,3、每张切片滴加一滴或50,l 3%H,2,O,2,（试剂 A）,，,室温下孵育10分钟，以阻断,内源性过氧化物酶。,4、PBS冲洗（3,3,）,免疫组织化学的原理及应用,第42页,5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50,l,非免疫动物血清（试剂 B），室温下孵,育10分钟。,6、甩取血清，每张切片滴加一滴或50,l,第一,抗体，室温下孵育60分钟或4,C,过夜。,7、PBS冲洗（3,5,）,8、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50,l,第二抗体（试剂 C），室温下孵育、,10分钟,9、PBS冲洗（3,3,）,免疫组织化学的原理及应用,第43页,10、甩取PBS液，每张切片滴加一滴50,l,链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,（试剂 D），室温下孵育10分钟。,11、PBS冲洗（3,3,）,12、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100,l,DAB或AEC显色液，显微镜下观察,3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。,13、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL,分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。,14、假如用DAB显色，则切片经过梯度酒,精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；,免疫组织化学的原理及应用,第44页,假如用AEC显色，则切片不能用酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。,假如组织内源性生物素含量高或因为热修复造成内源性生物暴露，可在加,3%H,2,O,2,之前，用内源性生物素阻断剂,加以阻断之后继续免疫组化染色。,免疫组织化学的原理及应用,第45页,（二）Envision法染色步骤:,1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4),冲洗三次,每次三分钟（3,3,）。,2、依据每一个抗体要求，对组织进行对应,修复。,3、每张切片滴加一滴或50,l 3%H,2,O,2,室温,下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。,4、PBS冲洗（3,3,）,免疫组织化学的原理及应用,第46页,5、,甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50,l,第一抗体，室温下孵育60分钟或4,C,过夜。,6、PBS冲洗（3,5,）,7、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50,l,聚,合物增强剂（试剂 A）,，,室温下孵育20分,钟。,8、,PBS冲洗（3,3,）,9、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50,l,酶,标抗鼠兔聚合物，（试剂 B）室温下孵,育30分钟。,10、PBS冲洗（3,3,）,免疫组织化学的原理及应用,第47页,11,、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100,l,DAB或AEC色液，显微镜下观察,3-10分钟阳性显色为棕色或红色。,12、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL,分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。,13、假如用DAB显色，则切片经过梯度酒,精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；,假如用AEC显色，则切片不能用酒,精脱水，而直接用水性封片剂封片。,免疫组织化学的原理及应用,第48页,免疫组化在肿瘤研究中应用,1、提升病理诊疗准确性，确定肿瘤起源及类型。,经过检测细胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）;细胞功效产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE,CgA等）;细胞表型标识物，属细胞膜抗原（如LCA,EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA,AFP).确定肿瘤起源,免疫组织化学的原理及应用,第49页,胰腺:,腺泡细胞癌：CK8+、CK18+,导管分化癌：CK7+、CK19+,免疫组织化学的原理及应用,第50页,肝脏肿瘤,Hep-par-1,AFP,CK8,CK18,CK7,CK19,CK高,CK低,CA19-9,CK20,HCC,+,+/_,+,+,-/+,+,-/+,ICC,+,+,+,+,-/+,+,+/+,-/+,MAC,胃肠道转移性腺癌,+/_,+,+,+,+,+,+,免疫组织化学的原理及应用,第51页,甲状腺及滤泡旁细胞,甲状腺滤泡上皮发生癌 髓样癌,1、Tg +,2、TTF-1 +,3、Syn +,4、Cg-A +,5、Calcitonin +,6、CEA 少+多+,免疫组织化学的原理及应用,第52页,乳头状癌 正常,CK高 +,Galectin-3/HBME-1 +,CK19 +,Vimitin +,S-100 +,P53 +,MC +,CD56 +,甲状旁腺,PTH +（甲状旁腺激素）,Syn+、Cg-A+、CK8+、CK18+、CK19+,Ki-675注意复查,免疫组织化学的原理及应用,第53页,类癌、不经典类癌、小细胞癌,TTF-1 +/-+,Ki-67 4050 60 80,CD57 +,CD56 +,SYN +,CgA +,NSE +,免疫组织化学的原理及应用,第54页,男性生殖系统,前列腺疾病,一、前列腺标识物,1,、前列腺特异性抗原（,PSA,）,（浆+）,正常：在雄激素调整下腺泡上皮、导管上皮分泌,是前列腺起源肿瘤敏感、特异标识物，但不能区分良恶性,（,1,）前列腺腺泡上皮、导管上皮：顶端胞质,+,（,2,）良性增生上皮：顶端胞质,+,（,3,）前列腺癌（除外分化最差）均阳性,分化越高，阳性越强,（,4,）偶然前列腺以以外组织局灶弱,+,（多为尿路腺上皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮,免疫组织化学的原理及应用,第55页,2、高分子量角蛋白34,12（浆+）,CK5/6（浆+）,P63（核+）,能区分良恶性,:,增生良性 PIN,：基底细胞（浆+）,癌：,能帮助区分良恶性,-甲基酰基辅酶消旋酶（P504s）（浆+）,癌：敏感性、特异性表示约80100,正常（偶然腔面+）,萎缩型腺体结节性增生（,12%+）,非经典性腺瘤性增生（,AAH,）（,17%+）,高级别,PIN（90%+）,前列腺间质平滑肌、尿路上皮癌、肾细胞癌、及结肠癌也可,+,免疫组织化学的原理及应用,第56页,IGCNU,精原细胞瘤,胚胎性癌,卵黄囊瘤,混合型生殖细胞肿瘤,间质细胞瘤,支持细胞瘤,PLAP,+,+弥,+,+,AFP,+,+弥,+,HCG,+,+,+,HPL,可+,+,inhibin,合体+,+弥,+弥,CD117,+,+弥,CD99,Vimentin,+,+,+,CD30,+弥,MelanA,神经内分泌,+,+,+,+,CK,广+8+,18+高,广+弥,19+弥,+,+/_,+,E M A,CEA,/合体+,/合体+,/合体+,/合体+,/合体+,免疫组织化学的原理及应用,第57页,3、子宫内膜间质肿瘤 平滑肌肿瘤,SMA +,SMSA +,Desmin -+,H-caldesmin -+特异,CD10 +-,4、平滑肌瘤 平滑肌肉瘤,ER/PR +,Bcl-2 +,P53 +,MIB-1 +,免疫组织化学的原理及应用,第58页,1、胎盘结节、滋养叶细胞肿瘤,Ki-67 -/少许+14%+/-7%,2、蜕膜组织、滋养叶细胞,MEL-CAM -中间滋养+,PLAP -中间滋养+,CK -+,VIM +-,HCG -+,CD10 +-,免疫组织化学的原理及应用,第59页,3、,女生 结肠 肝细胞癌 肺小细胞癌 肾癌,CK7 +-,CK20 -+-,4、间皮,MC+CR+CK5/6+,免疫组织化学的原理及应用,第60页,（三）胃肠间质瘤(GIST),起源于,Cajal,细胞前驱细胞，表示,KIT,酪氨酸激酶受体（,CD117,）,似平滑肌样肿瘤胃肠道间叶性肿瘤。,形态多样：,平滑肌分化：,梭形细胞，胶原丰富，核旁空泡,-,似平滑肌瘤；,神经分化：核灶性栅栏状排列,-,似神经鞘瘤；,细胞增大，多角形，上皮样,-,似上皮样平滑肌,瘤或肉瘤。,非平滑肌和神经,免疫组化：,CD117,膜、胞质或核旁阳性，DOG-1+，,CD34,阳性（,70-80%,），,SMA,阳性（,30-40%,）,Desmin,阳性,S-100 阳性,NF可阳性,免疫组织化学的原理及应用,第61页,胃肠道间质瘤,A,溃疡位于病变上端,B,切面显示向管壁扩展。,免疫组织化学的原理及应用,第62页,间质瘤,A,栅栏状核似神经鞘瘤,B,梭形细胞有显著细胞浆空泡,C,上皮样型,免疫组织化学的原理及应用,第63页,恶性胃肠道间质瘤,A,肿瘤细胞围绕血管形成血管旁细胞套，外周为坏死,B,可见数个核分裂。,免疫组织化学的原理及应用,第64页,胃肠间质瘤,A 瘤细胞间见嗜伊,红色胶原纤维团块,B CD34强阳性,免疫组织化学的原理及应用,第65页,胃肠间质瘤,A,上皮样型,B Vimentin,阳性,免疫组织化学的原理及应用,第66页,一、GIST是一组异质性肿瘤,多数情况下，激酶基因突变是主要致癌事件1,2,KIT,：80-85%1,PDGFRA,：72,野生型（无法检测到突变）：10-15%1,SDH-deficient GIST,突变造成激活酪氨酸激酶受体连续异常表示(KIT或PDGFRA)3,Gain of function mutation,PDGFRA，血小板源性生长因子受体,；,PDGFRA,，血小板源性生长因子受体,基因,1.Corless CL et al.,J Clin Oncol,.;22:3813-3825.,2.Heinrich MC et al.,Science,.;299:708-710.,3.Trent JC et al.,Curr,Opin Oncol.,;18:386-395.,免疫组织化学的原理及应用,第67页,Molecular Classification of GISTs,KIT,Exon 11,Most common site of mutation,Exon 9,2,nd,most common site of mutation,Exons 13&17,Rare,PDGFRA,Exons 12&14,Rare,Exon 18,3,rd,common site of mutation,“Wild-type”,Molecular etiology unclear,Familial GIST,Germline,KIT,or,PDGFRA,mutation,Carney-Stratakis,Germline mutations in,SDH（A,B,C,D),Pediatric,KIT,&,PDGFRA,mutations are rare,Carneys triad,No,KIT,or,PDGFRA,mutations,NF-1,-related,No,KIT,or,PDGFRA,mutations,免疫组织化学的原理及应用,第68页,胃肠道间叶起源肿瘤,CD117,免疫组化检测,GIST,是,desmin,检测阳性,平滑肌瘤,是,否,S-100,检测阳性,神经鞘瘤,是,DOG1,检测,GIST,是,否,野生型,GIST,其它肿瘤,KIT,基因检测,GIST,PDGFR,基因检测,否,GIST,是,是,是,否,GIST诊疗流程,-GSIT 中国共识,中国GIST诊疗治疗教授共识,免疫组织化学的原理及应用,第69页,2、胃肠道间质瘤,CD117+（主要）、DOG-1（主要）、CD34+,Desmin+/、SMA/MSA+/,S-100+/、NF+/,P63+、P53+、Ki-67+预后差,3、,Barrett,食管,免疫组织化学的原理及应用,第70页,SDH-deficient GIST,占GIST5%7.5%,临床上常以综合征形式表现,（如Carney三联征或Carney-Stratakis 综合征）,好发于胃，上皮样GIST，多结节性,淋巴管瘤栓，淋巴结转移,免疫组化:可表示CD117和DOG1，不表示SDHB,c-kit或PDGFRA基因突变检测显示为野生型,核分裂象不能评定危险度，发生转移间隙期较长，故需长久随访,免疫组织化学的原理及应用,第71页,CD34,+in 70%GISTs:47%in small intestine;96%in rectum;100%in esophogus,CD34 is not specific for GISTs,CD34+:孤立性纤维性肿瘤（90%）,炎症性纤维性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮肤隆突性纤维肉瘤,（90%）、一些神经肿瘤、卡波西肉瘤、多数血,管肉瘤、许多上皮样肉瘤,免疫组织化学的原理及应用,第72页,免疫组化在肿瘤研究中应用,1、提升病理诊疗准确性，确定肿瘤起源及类,型。,经过检测细胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）;细胞功效产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE,CgA等）;细胞表型标识物，属细胞膜抗原（如LCA,EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA,AFP).确定肿瘤起源,2、一些激素受体及生长因子检测可判断预后。,如：PR、ER、,免疫组织化学的原理及应用,第73页,免疫组化在肿瘤研究中应用,3、癌基因蛋白研究，研究肿瘤发生、发展,过程，如各种癌基因、抑癌基因及其相关,原因。,P53:恶变,Bcl-2：淋巴结生发中心反应性和淋巴瘤区分,Cer-b-B-2：,乳腺导管内上皮重度非经典增生和,乳腺导管内癌区分,免疫组织化学的原理及应用,第74页,4、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发,提供参考。如ki-67,PCNA等。,5、检测肿瘤组织转移潜能，如nm23-H,CD44V6,MMP等。,6、帮助判定肿瘤分期,LN和,型可显示有没有浸润,7、提升微小癌灶发觉率,8、指导肿瘤治疗,PR、ER、Cer-b-B-2和许多耐药基因检测,9、免疫性疾病辅助诊疗,10、病原生物检验,如：HPV、EB、HP等,免疫组织化学的原理及应用,第75页,免疫组化染色注意事项,：,（一）抗体保留和配制,1、保留：,浓缩抗体：-20-40,C 约12年,即用型抗体；4,C 约1年,2、抗体配制：,浓缩抗体必须找抗体最正确稀释度,即用型抗体直接使用,（二）正确设计对照,免疫组织化学的原理及应用,第76页,阴性对照（PBS或非免疫血清）、阳性对照（购置或自己搜集）、本身对照,、,抑制对照和吸收对照。,抑制对照和吸收对照普通不用。,（三）出现假阳性几个常见原因,1、抗体稀释度不够，浓度太高。,2、抗体与各种抗原有交叉反应。,3、抗体与组织中一些成份非特异性结合，,出现异常表示，如：S-100在鳞状上皮表示。,4、内源性酶显色,免疫组织化学的原理及应用,第77页,5、肿瘤与病变组织中有其它组织残留,（尤其是肿瘤中有正常组织残留）,6、抗原弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原,在不该出现部位出现。,7、异位抗原表示，（有些人认为是交叉,免疫反应）,8、内源性生物素影响。,免疫组织化学的原理及应用,第78页,表2：生物素在正常组织中分布情况,组织,生物素,组织,生物素,组织,生物素,舌鳞状上皮,-,喉黏膜腺管,+/1,卵巢间质,-,舌横纹肌,-,支气管上皮,+/3,卵巢颗粒细胞,+/2,食道鳞状上皮,-,支气管腺体,+/2,乳腺小叶、导管,+/3,胃上皮,-,肺泡,-,乳头鳞状上皮,-,胃腺体,+/3,肾脏近曲管,+/3,脑胶质,-,十二指肠平滑肌,-,肾脏远曲管,+/3,神经元,+/3,12指肠上皮腺体,+/3,肾小球,-,神经纤维,-,小肠上皮,+/2,肾集合管,+/3,甲状腺腺泡,+/2,小肠上皮、腺体,+/2,肾盂移行上皮,+/3,甲状腺C细胞,+/3,阑尾上皮、腺体,+/3,膀胱,+/2,甲旁腺嗜酸细胞,+/3,结肠上皮、腺体,+/3,前列腺,+/3,肾上腺皮质,+/3,直肠上皮、腺体,+/3,尿道上皮,+/3,肾上腺髓质,-,肛门鳞状上皮,-,睾丸曲细精管,+/3,胃内分泌细胞,+/3,腮腺导管,+/3,附睾支持细胞,+/2,睾丸间质细胞,+/3,腮腺腺泡,-,输精管上皮,+/2,胰岛,-,颌下腺导管,+/3,宫颈鳞状上皮,-,淋巴结,-,颌下腺腺泡,-,宫颈柱状上皮,-,扁桃体,-,胰腺腺泡,-,宫颈腺上皮,+/2,脾,-,胰腺导管,+/3,增殖期内膜腺体,+/2,浆细胞,+/3,肝细胞,+/3,分泌期内膜腺体,+/3,皮肤鳞状上皮底层,+/3,胆管,+/2,蜕膜腺体,+/2,皮脂腺,+/3,胆囊,+/3,蜕膜细胞,+/3,脂肪细胞,+/3,鼻黏膜上皮,+/2,胎盘绒毛,+/2,平滑肌,-,鼻黏膜腺体,+/2,脐带,-,横纹肌,-,会厌黏膜,-,输卵管,+/1,心肌,+/3,血管,-,注：-阴性；+/1 弱阳性点状分布；+/2 中度阳性片状分布；+/3 强阳性弥漫分布。,免疫组织化学的原理及应用,第79页,HE,未修复,修复,修复+封闭,修复+DAB,标准CK,免疫组织化学的原理及应用,第80页,生物素,生物素,标准CK,生物素+CK,免疫组织化学的原理及应用,第81页,胃内分泌细胞,免疫组织化学的原理及应用,第82页,皮脂腺,免疫组织化学的原理及应用,第83页,垂体腺瘤,免疫组织化学的原理及应用,第84页,腺淋巴瘤,免疫组织化学的原理及应用,第85页,大鼠肾脏,免疫组织化学的原理及应用,第86页,大鼠肝脏,免疫组织化学的原理及应用,第87页,大鼠胰腺,免疫组织化学的原理及应用,第88页,研究显示,（1）冰冻组织中存在内源性生物素。,（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。,（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。,（4）内源性生物素暴露强度各不相同，从弱阳性（+）,到强阳性（+）。,（5）内源性生物素在组织中分布形式，现有散在分布,也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。,（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，尤其是腺,上皮组织，亦存在部分非上皮组织。,（7）内源性生物素不但存在人体组织，也存在大鼠组织。,（8）内源性生物素暴露强弱与修复液相关，其强度增,加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。,（9）热抗原修复暴露内源性生物素可被鸡蛋清封闭。,免疫组织化学的原理及应用,第89页,提议,为了防止免疫组化中内源性生物素干扰，凡采取冰冻切片或石蜡切片加热抗原修复用非生物素检测系统：,1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采取蛋清或,卵白素作为封闭剂。,2、或采取非生物素检测系统，如EnVision等。,3、应坚持使用阴性对照。,免疫组织化学的原理及应用,第90页,（四）出现假阴性几常见种原因,1、抗体和检测试剂盒配对不合理（现在一,般用通用型可防止试剂盒配对不合理）,2、抗体浓度太低,3、孵育时间太短（依据要求做）,4、固定和温度,有抗体不适适用于福尔马林固定组织，仅适适用于冰冻切片；固定、包埋温度过高，抗原丢失（,62,C）,5、染色步骤不正确,6、染色过程中切片过分干燥,免疫组织化学的原理及应用,第91页,（五）出现背景着色几个常见原因,1、内源性过氧化物酶没有阻断,2、正常动物血清使用不合理（如二抗为羊抗鼠 IgG,因该用羊血清)。,3、脱蜡不够彻底,4、组织粘贴剂使用不妥或太浓,5、PBS冲洗不够,6、抗体稀释不合理，浓度太高。,7、底物显色时间太长,免疫组织化学的原理及应用,第92页,（六）显示剂合理使用和增强方法,1、显示剂：当前最惯用,DAB 和 AEC 仅用于HRP系统,AP-Red 和 Fast-Blue 仅用于AP系统,2、增强剂：主要是在DAB显色加一些金,属离子。如：镍、铜、钴等,（七）结果判定标准,1、阳性细胞定位是否明确（膜、浆、核）,2、间质是否清楚,3、有没有背景着色,免疫组织化学的原理及应用,第93页,4、依据不一样情况判定阳性标准,（有阳性细胞数在5%以上才定为阳性）,5、注意抗原联合表示,如：分化差癌可表示间叶成份,免疫组织化学的原理及应用,第94页,（七）免疫组织化学染色中常见脱片原因,1、组织固定、脱水、透明不充分。,2、组织切片过厚。,3、组织切片有折叠。,4、过分热抗原修复（高压、微波、水煮）处理或抗原修复液pH偏高。,5、操作过程中，冲洗方法不正确等。,免疫组织化学的原理及应用,第95页,G.结果判断,背景洁净,位置正确,免疫组织化学的原理及应用,第96页,免疫组织化学的原理及应用,第97页,免疫组织化学的原理及应用,第98页,免疫组织化学的原理及应用,第99页,免疫组织化学的原理及应用,第100页,免疫组织化学的原理及应用,第101页,免疫组织化学的原理及应用,第102页,免疫组织化学的原理及应用,第103页,免疫组织化学的原理及应用,第104页,Dako,c-kit,malignant mesothelioma,免疫组织化学的原理及应用,第105页,Dako,c-kit,malignant mesothelioma,免疫组织化学的原理及应用,第106页,Dako,c-kit,malignant mesothelioma,免疫组织化学的原理及应用,第107页,Dako,c-kit,malignant mesothelioma,免疫组织化学的原理及应用,第108页,免疫组织化学的原理及应用,第109页,Dako,c-kit,GIST,免疫组织化学的原理及应用,第110页,免疫组织化学的原理及应用,第111页,免疫组织化学的原理及应用,第112页,免疫组织化学的原理及应用,第113页,免疫组织化学的原理及应用,第114页,免疫组织化学的原理及应用,第115页,免疫组织化学的原理及应用,第116页,免疫组织化学的原理及应用,第117页,免疫组织化学的原理及应用,第118页,P16,anorectal SCC,免疫组织化学的原理及应用,第119页,P16,anorectal SCC,免疫组织化学的原理及应用,第120页,P16,anorectal SCC,免疫组织化学的原理及应用,第121页,Breast lobular carcinoma in thyroid gland,TG,免疫组织化学的原理及应用,第122页,一.免疫组化汇报,取材 封片 观察,（共10分）,免疫组织化学的原理及应用,第123页,一块已知食管鳞状细胞癌组,织，周围带有少许正常食管组,织，让你用免疫组化Envision法、,用第一抗体为鼠抗人单克隆抗体,CK,AE1/AE3,以检测该食管鳞状细胞,癌组织情况,你怎样做出一张,合格免疫组化切片?,免疫组织化学的原理及应用,第124页,要求：,1、试验目标：,2、试验方法：,3、使用试验设备和药品：,4、试验步骤：,5、试验结果：,二、免疫组织化学染色切片,（10分）,免疫组织化学的原理及应用,第125页,谢 谢,免疫组织化学的原理及应用,第126页,免疫组织化学的原理及应用,第127页,免疫组织化学试题,免疫组织化学的原理及应用,第128页,一.免疫组化汇报,取材 封片 观察,（共15分）,免疫组织化学的原理及应用,第129页,一块已知肺鳞状细胞癌组,织，周围带有少许正常肺组,织，让你用免疫组化Envision法、,用第一抗体为鼠抗人单克隆抗体,CK,AE1/AE3,以检测该肺鳞状细胞,癌组织情况,你怎样做出一张,合格免疫组化切片?,免疫组织化学的原理及应用,第130页,要求：,1、试验目标：,2、试验方法：,3、使用试验设备和药品：,4、试验步骤：,5、试验结果：,二、免疫组织化学染色切片,（10分）,免疫组织化学的原理及应用,第131页,免疫组织化学的原理及应用,第132页,第二章 组织化学与免疫组织化学染色样品制备,取材固定脱水透明浸蜡包埋修块切片防脱片处理捞片烤片进行各种染色脱水透明封片镜下观察,免疫组织化学的原理及应用,第133页,第一节,取材,一、组织标本取材：,1、要求：,尽可能保持生活状态下形态结构完,整性（材料尽可能新鲜）,尽可能保持化学成份和酶活性,保持组织细胞抗原不受损,2、注意事项,材料及时送检（及时固定,510倍固定,液），尽快取材 （及时固定或及时冷冻,切片或-80保持备用）（尽可能新鲜）,免疫组织化学的原理及应用,第134页,预防人为原因影响。如：防止挤压，刀刃,要尖锐，不可重复切拉组织,组织块大小适中：过大过,厚,固定不良,普通：1.51.50.20.3cm,3,最大:2.52.50.20.3cm,3,免疫组化:110.2cm,3,电镜:0.3 0.30.5cm,3,注意切面:目标组织细胞一定在目标切面上,注意特殊情况：,缝线、钙化、血液、粘液、粪便等需要先处理,免疫组织化学的原理及应用,第135页,取材部位:,主要病变、交接区、远离病变区正常,动物取材：麻醉处死取材,乙醚吸入麻醉法：,大白鼠、豚鼠,戊巴比妥钠和乌拉坦：,3戊巴比妥钠 或20乌拉坦,腹腔或静脉注射12ml,空气栓塞法,尽快切断主动脉放血后在取材,免疫组织化学的原理及应用,第136页,二、细胞标本取材：,（一）培养细胞,1、贴壁生长细胞,在接种细胞前，把涂有黏附剂小盖玻片放入培养板中，接种后细胞 自然爬到小盖玻片上生长，取材时，将小盖玻片用预热PBS液轻轻冲洗，沥干后即可放入固定液内。,免疫组织化学的原理及应用,第137页,2、悬浮生长细胞,制备浓度为210,5-6,细胞/ml悬液，取50100l，加入离心涂片机内，1000r/min离心2分钟即可均匀分布于已涂黏附剂载玻片上。,免疫组织化学的原理及应用,第138页,3、印片法,主要应用于活组织标本检验和剖检标本取材。将载玻片轻轻压于病变区，脱落细胞便黏附在玻片上，马上将载玻片浸入细胞固定液内510分钟，自然干燥，低温保留备用。优异是简便省时，细胞抗原保留很好；缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞有重合。,免疫组织化学的原理及应用,第139页,（二）涂片法 取含有细胞液体（腹水、胸水和心包液）或气管、宫颈等分泌物直接涂片，加入12ml Hanks液（或细胞培养液）轻轻混匀，500r/min离心510分钟，弃上清液，制成细胞悬液（210,6,细胞/ml），使用细胞离心涂片机或吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。,免疫组织化学的