男科学实验室诊断进展幻灯片.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,男科学实验室诊断进展,1,精液分析是评价男性生育能力的最基本检验手段。理论上，精液分析是一个很简单的操作过程，只要将一滴精液置于玻片上，进而确定其相关参数即可。然而，实际上，精液分析所得的每一个参数都需要大量的专业知识、细致认真的操作及必要的质量控制措施。,2,Keel,等报告了美国纽约、哥伦比亚、洛山矶、明尼苏达几百家男科实验室对精子密度、形态学、活率及抗精子抗体的室间质量控制结果，精子密度的结果显示，一份精液标本的精子密度差异范围达,3 492,10,6,/ml,，手工检测的变异系数（,CV,）为,30%138%,，计算机辅助的精液分析（,CASA,）的,CV,为,24%99%,。不同实验室精子密度的较大差异提示，精子计数方法的不同、计数池种类的不同以及操作的标准化对精子计数结果有着直接的影响。,3,一、精液常规检查,1,、精液检测工具不断更新,（,1,）血细胞计数板 沿用,50,余年,（,2,）,Makler,精子计数板,1978,年以色列,Makler,发明,（,3,）,Macro,精子计数板,（,4,）,Microcell,计数池,1990,年,Ginabury,和,Armand,发明 一次性使用,（,5,）,2004,年，美国,Millennium Sciences,公司,Cell-VU,精子记数池和,Cell-VU,预染色形态载波片。,4,计算机辅助的精液分析,80,年代发展的新技术，除可分析精子密度、活动百分率等指标外，在分析精子运动能力方面显示了其独特的优越性。,5,6,7,8,9,10,11,12,全自动精子分析仪（以色列）,Medical Electronic Systems,13,用已知浓度的乳胶珠溶液对目前国际上常用的种精子计数池进行了评价。,种精子计数池的质量评估,14,1,材料与方法,1.1,实验材料,Cell-VU,计数池,（,Millennium Sciences Inc,，,New York,，,USA,）,Makler,计数池,（,Sefi-Medical Instrument,，,Haifa,，,Israel,）,血球计数池,（,上海求精生化试剂仪器有限公司）,标准乳胶珠溶液,（,Hamilton Thorne Biosciences,，,USA,）,2,份，浓度分别为：,（,355,）,106/ml,，（,182.5,）,106/ml,。,15,1.,方法,1.2.1 Cell-VU,计数法,1.2.2 Makler,计数法,1.2.3,血球计数池法,1.,统计学分析,不同计数池的计数结果以,x,s,表示，样本均数的比较采用,t,检验,16,2,结果,Chamber,n,Concentration forstandard solution 1,Concentration forstandard solution 2,Cell-VU,30,37.634.89,18.221.77,Hemacytometer,30,42.744.98,*,20.481.56,*,Makler,15,53.526.67,*,24.974.75,*,表,1,不同精子计数池的乳胶珠浓度,与,Cell-VU,计数池相比，*：,P,0.001,；与血球计数池相比，：,P,1,10,6,/ml,，可诊断为白细胞精子症,白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧（,ROS,）、分泌一些细胞因子等途径使精子损伤。精液中粒细胞为产生,ROS,的主要细胞。,25,精液中白细胞的检测方法；,1,、对,ROS,的检测：依赖鲁米诺的化学发光分析法,2,、直接镜检法,3,、瑞,-,姬染色或巴氏染色法染色,4,、过氧化物酶染色法（正甲苯胺兰、联苯胺及邻甲苯胺过氧化物酶染色）,5,、荧光原位杂交法,6,、免疫细胞化学法,CD45,，,CD4,，,CD8,7,、弹性蛋白酶、,IL-8,及溶菌酶测定,26,四、免疫性不育的检测,检测方法很多，,3,种类别的抗精子抗体均可测，检测的抗精子抗体为总的或各种类别的抗精子膜抗原的抗体，而精子膜与人体其他器官组织的细胞膜有许多共同抗原，因而这种抗原抗体反应的特异性不高。如果用,针对精子或睾丸特异性抗原，或针对与透明带识别和结合有关的抗原作为包被抗原,来检测,AsAb,，其临床意义就会很大。,Naz,等用现代分子生物学技术确定，,受精抗原,FA-1,和,YLP,（,12,）,具有此特性，并且它们的抗体存在于不育男性的精浆和血清中建立这种特异性诊断方法是今后取代总,AsAb,检测的唯一途径。,27,五、,生殖道感染的检测,大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、结核杆菌、衣原体、支原体、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、腺相关病毒、阴道毛滴虫等皆可感染生殖道，而且可致不育。,各种细菌感染，往往通过菌体本身及其释放出的毒素、酶类等影响精子质量,病毒的感染更为隐蔽临床实验室多用,ELISA,法检测各种病毒的抗体，通过抗体的分型可粗略判断病毒的感染时期,28,衣原体和支原体感染,被认为是最常见的性传播疾病（,STD,）病原,与男性不育密切相关的衣原体为,沙眼衣原体（,CT,）,，其可引起急性附睾炎和慢性前列腺炎等。目前，检测沙眼衣原体感染的方法主要有金标法、,ELISA,法及培养法，尤以,ELISA,法最为常用,与男性不育密切相关的支原体为,解脲支原体,临床实验室多采用培养法检测。,29,六、,精浆生化的检测,精浆中的一些生化标志可反映男性附属性腺、附睾及睾丸生精功能等，有利于综合评价不育的发病原因和机制。,例如，,柠檬酸、锌、镁、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶,可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶检测已成为男科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法；,果糖与前列腺素,可反映精囊腺功能，常用间苯二酚法检测果糖；,游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和,-,葡糖苷酶,可反映附睾功能。,30,精浆总,-,葡糖苷酶检测中应注意,3,点,离心速度不同，精浆总,-,葡糖苷酶活性有所差异,精浆总,-,葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关,精浆总,-,葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制,31,不同速度离心后的精浆中,葡糖苷酶水平,32,禁欲时间对精浆,葡糖苷酶的影响,Abstinence time(day),n,Alpha-glucosidase(U/ml),Seminal plasma(1 000 g for 10 min)Seminal plasma(3 000 g for 15 min),2 3,12,36.4712.24,34.0411.22,4 5,16,49.6216.86,*,47.7317.37,*,6 7,14,51.1419.76,*,46.7617.70,*,8,9,68.7014.10,*#,63.8613.63,*#,33,精浆果糖检测中应,注意,4,点,：,果糖标准液配制后应放置,2,周后使用，而使用,2,周 后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液,离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异,精液液化后应立即离心将精子和精浆分离，否则会影响精浆果糖检测结果,精浆果糖测定中应引入质量控制体系,34,果糖标准液吸光度的监测,35,精液,放置时间对果糖浓度的影响,Group,n,Fructose(mmol/L),0 h,48,15.73,6.56,2 h,48,15.07,6.56,a,4 h,48,14.73,6.51,b,c,36,精浆稀释后放置时间对酸性磷酸酶活性的影响,随机选取,10,例精浆，,110 000,稀释后,立即检测,ACP,活性或稀释后,放置,30 min,再次检测,ACP,活性，两者比较有,极显著性差异,（,t,3.770,，,P,0.001,）。,37,抑制素,B,被认为是男性精子发生的血清标志物。,成年男性血清中维持可检测的抑制素,B,水平需要生精细胞的存在，唯支持细胞综合征（,SCO,）男性血清抑制素,B,水平极低。,Brugo-Olmedo,等认为血清抑制素,B,在预言非阻塞性无精子症病人的睾丸精子存在时比血清,FSH,更准确。,除此之外，抑制素,B,还可用于儿童隐睾、性早熟的诊断，监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。,目前，抑制素,B,的检测通常使用,双抗体夹心,ELISA,法。,38,七、,精浆细胞因子的检测,精浆细胞因子由男性泌尿生殖道内的各种细胞分泌，包括转化生长因子（,TGF,）、表皮生长因子（,EGF,）、肿瘤坏死因子（,TNF,）、各种白细胞介素（,IL,）及某些可溶性受体等。目前认为，与男性不育有关的细胞因子主要有,IL-6,和,IL-8,，不育病人精浆中,IL-6,和,IL-8,水平明显高于生育力正常的男性。,测定,IL-6,和,IL-8,的方法有：生物学方法、分子生物学方法和免疫学方法，以免疫学方法多用，尤以,ELISA,和,RIA,常用。,39,八、,精子发生相关基因的检测,与精子发生相关的基因很多，无精子病人的基因缺失均发生于,Y,染色体的长臂,主要位于,Yq11.23,中，而且并非是单一基因，可能含有整个基因大家族。,1996,年，,Vogt,等人在更大范围对无精子、少精子病人进行了研究，认为在,3,个区域均存在,AZF,，分别为,AZFa,，,AZFb,，,AZFc,，对这些病人睾丸活检发现，睾丸的病理改变与,AZF,的缺失部位有显著相关性,。,AZFa,：,Sy84,Sy86,AZFb,：,Sy124,，,Sy127,，,Sy132,Sy134,AZFc,：,Sy152,，,Sy157,，,Sy239,，,Sy242,，,Sy254,，,Sy255,40,AZF,检测：,SRY,存在于基因组中，,Yq,上的,AZFa,b,c,区域的位点全部丢失,病人 正常男性 正常女性 空白对照,41,九、,遗传学检测,男性不育的遗传学检测主要是,检测精子染色体的异常。,常规使用,染色体显带技术,，如,G,带、,Q,带等技术，然而其敏感度不及,FISH,技术,FISH,技术,可用于研究复杂染色体突变如性染色体异常、未知的小标志物、环状染色体、嵌合体及易位等,Y,染色体长臂特异区的微缺失与不育相关,42,病例：,46,，,XX/46,XY,异源嵌合体导致真两性畸形,腹腔镜检查发现：,子宫正常大小，发育良好,左右性腺均约,4,3,2cm,，中间均为黄色组织，两端为白色组织。未见排卵痕迹。双侧输卵管发育好，均有游离伞端,术中探察阴道深度约,7cm.,腹股沟管内未见睾丸及其它男性性器官,43,卵睾和输卵管，白色组织为睾丸组织，黄色为卵巢组织,44,核型分析：,46,，,XX,45,核型分析：,46,，,XY,46,外周血淋巴细胞,:FISH,（,X/Y,着丝粒探针）：有,XX,和,XY,的细胞,47,皮肤成纤维细胞,:FISH,（,X/Y,着丝粒探针）：有,XX,和,XY,的细胞,48,睾丸成纤维细胞,FISH:,（,X/Y,着丝粒探针）：有,XX,和,XY,的细胞,49,卵巢成纤维细胞,:FISHX/Y,着丝粒探针）：有,XXXY,的细胞,50,结 论,男性不育是最常见的而且可以鉴定的人类生育失败的原因之一。尽管对精子生理学和精子与配子相互作用的生物学过程的研究已取得很大进展，各种各样的检测方法层出不穷，但目前更多的工作应着重于确定那些预言精子特征十分准确、与配子受精能力密切相关的临床男科诊断实验，并应对这些实验的客观性进行评价，这些实验应简便、经济实用、并提供一致的结果，而且应对它们标准化,。,51,谢 谢！,52,