荧光素&流式技术..ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,荧光素,&,流式细胞术,杨 培,2014.02.11,1,荧光素介绍,流式细胞术基本原理,流式细胞术的应用,流式胞内因子的流式检测,流式多色,Panel,设计,主 要 内 容,2,一,.,荧光素介绍,3,荧光素（,Fluorescein,）是具有光致荧光特性的染料，,荧光染料,种类很多。,荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有,共轭双键,的化合物。,荧光素介绍,4,5,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（,nm,）,激发光谱（,Excitation,，,Ex,）：,是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。,吸收波峰（最大吸收波长）：,Ex-Max,发射光谱（,Emission,）：,是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光,发射波峰（最大发射波长）：,Em-Max,荧光素的使用：,选择正确的激光器,确定所需荧光探测器（,PMT,）,488nm 520nm,异硫氰酸荧光素,（,FITC,）,荧光素介绍,6,Blue,（,488nm,）,FITC,Alexa Fluor 488,PE,PerCP,PerCP-Cy5.5,PE-Cy5,PE-Cy7,PI,7-AAD,Red,（,633nm,）,APC,APC-Cy7,AF647,AF700,Violet,（,405nm,）,AmCyan,Brilliant Violet 421,Pacific Blue,Brilliant Violet 510,Brilliant Violet 570,Brilliant Violet 605,Brilliant Violet 650,Brilliant Violet 711,Brilliant Violet 785,Qdot 605,UV (360nm,）,DAPI,常用荧光素,荧光素介绍,7,第二步：荧光素的选择,荧光素光谱分析网络工具：,Fluors,Cy dyes,Horizon,Dylight,etc,蛋白,PE,APC,GFP,mCherry,半导体纳米,Qdots,Crystalplex,eFluorN,C,有机聚合物,Brilliant Violet,Alexa,488,PE,Cy5,Cy5,Cy5,荧光素家族,11,Collisional Quenching,荧光素淬灭,12,耦合荧光素,13,耦合荧光素,anti-Mouse CD3e,clone 145-2C11-PE/Cy5,BioLegend,Competitor 1,耦合荧光素不同厂家，抗体荧光强度,不同：,F:P,值不同,耦合,荧光素对光、对固定剂更敏感,14,Brilliant Violet,TM,570,Brilliant Violet,TM,605,Brilliant Violet,TM,650,Brilliant Violet,TM,711,Brilliant Violet,TM,785,耦合荧光素家族,PE-Cy7,15,Brilliant Violent,TM,简称“,BV,”，是诺贝尔奖获得者发明的“最新一代”的荧光染料，“,BV,”染料是有机聚合物，它有很强的光吸收能力（消光系数）和光转换能力（量子产率），这些物理特性使“,BV,”的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。,Brilliant Violent,TM,荧光素家族，包括：,BV421,，,BV510,BV570,，,BV605,，,BV650,，,BV711,，,BV785,七个成员，充分利用流式细胞仪,405nm,激发管，与其它各种荧光素兼容性好。,Biolegend,公司可以提供最新最全的,BV,系列荧光抗体，,BD,目前只推出了四种！,Brilliant Violet,TM,荧光素家族,16,荧光素,荧光强度,激发光,滤光片,平行荧光素,Brilliant Violet,TM,421,5,405 nm,450/50,Pacific Blue,Brilliant Violet,TM,510,4,405 nm,510/50,或,525/50,BD Horizon V500,和,AmCyan,Brilliant Violet,TM,570,3,405 nm,585/40,Pacific Orange,Brilliant Violet,TM,605,5,405 nm,605/12,或,510/20,eFluor 605,和,Qdot605,Brilliant Violet,TM,650,4,405 nm,660/20,eFluor 650,和,Qdot650,Brilliant Violet,TM,711,4,405 nm,710/50,eFluor 700NC,和,Qdot705,Brilliant Violet,TM,785,3,405 nm,780/60,Qdot 800,17,荧光强度。（检测灵敏度及联接蛋白数量）,吸收光谱宽窄。（多色染色时不易漏光）,光稳定性。（光漂白）,Buffer,稳定性。（,PH,值稳 定）,机器兼容性。（激发光与接收光是否与大众化的机器相匹配）,荧光素评价指标,18,发射波长,(nm),530 580 630 680 730 780,FITC,PE,PE-,TR,PE-CY5,不同荧光素发射波长及波长宽窄不同,荧光素评价指标,-,荧光发射波长,19,荧光素评价指标,-,荧光强弱,20,二,.,流式细胞术基本原理,21,流式细胞术（,Flow Cytometry,简称,FCM,）是一种以流,式细胞仪为检测手段，可以快速、准确、客观，同时检,测单个生物微粒的多项特性，并加以定量的技术，同时,可以对特定群体加以分选。,特点,:,研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等,快速、准确、高通量检测,多参数、多色荧光分析,，对细胞特性的识别、计数更为准确,定性或定量分析细胞,分选特定性状或功能的细胞,流式细胞术原理,22,液流系统,光学系统,电子系统,分选系统,流式细胞仪的基本结构,23,流式细胞仪,-,光学系统,24,25,前向角散射光（,FSC,）：反映相对大小,侧向角散射光（,SSC,）：反映细胞,粒度及细胞内相对复杂性,前向角检测器,FSC,Laser,测向角检测器,s,SC,激光光源,信号检测,散射光信号,26,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,白细胞,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,根据散射光信号,从人白细胞中鉴别出不同亚群：,27,信号检测,荧光素荧光信号,28,CD3-FITC,CD19-PE,PI-Fluorescence,#Evnts,正常,G0/G1,期细胞,直方图,(Histogram),二维点图,(Dot Plot),三维图（,3D Plot,）等,直方图,(Histogram),二维点图,(Dot Plot),凋亡细胞峰,等高线图,(Contour Plot),密度图,(Density),流式数据,三维图（,3D Plot,）,29,流式细胞术常用分析软件,BD cellquest,BD FacsDiva,。,仪器自带分析软件,第三方分析软件,30,三,.,流式细胞术的应用,31,流式技术的应用,32,流式技术的应用,33,流式检测技术：了解细胞的特征,细胞亚群,细胞表型,细胞粘附分子,细胞因子受体,细胞胞内因子,细胞周期,34,四,.,流式胞内因子的流式检测,35,胞内检测,(ICFC or ICS)?,胞,内检测指标主要包括：,细胞因子,胞浆,转录因子,细胞核,细胞内抗原 或,细胞内结构标志物,信号分子,如：活化的蛋白激酶,36,胞内流式检测操作,表面,指标检测,固定,/,破膜,胞内指标检测,活化细胞,细胞因子阻断,37,5.20,1.81,37.5,3.92,1.03,60.8,IL-17,IFN-,38,流式细胞因子检测,检测的细胞：,是否分泌目标细胞因子,适合的细胞活化方法,分泌细胞因子的阻断：,阻断剂的添加与选择,固定，破膜：,固定,/,破膜试剂的选择,尽量选择强荧光素抗体检测,死细胞的去除,细胞因子流式检测，需要考虑的因素,：,39,细胞活化,细胞活化的一般方法：,PMA/Ionomycin,PHA/ConA,模拟,体内活化方法：,MHC,(,抗原,),TCR(CD3,CD28),细胞因子,(IL-2,IFN-r),，,LPS,细胞活化的,protocol,s,：,40,分泌细胞因子的阻断,细胞因子表达后快速分泌，如果不进行,阻断，则细胞内因子含量很低，无法检测,.,阻断剂包括,:,Brefeldin A(#420601),Monensin(#420701),阻断剂对细胞有一定毒性，与细胞接,触的时间越短越好,(2-24h),。,+Brefeldin A,+Monensin,41,细胞的固定与破膜,固定,:,多聚甲醛,(PFA),浓度,时间,温度,(,例如,.2%PFA,4C,10-15 min),与,荧光素，细胞,表面指标兼容,终止液,：,staining buffer+BSA,BioLegend Fixation Buffer(#,420801),破,膜,:,皂素,(0.05-0.2%),其他破膜剂,(MeOH,Tween 20,Triton X-100),后续步骤都需要破膜剂,:,洗涤步骤,抗体孵育,BioLegend Permeabilization Wash Buffer(#421002,),胞内因子与细胞核内指标检测，需选择不同的固定破膜剂！,42,核内指标染色,:FoxP3,T Reg,细胞鉴定：,CD4+CD25+,FoxP3+,BALB/c mouse splenocytes stained with Mouse Treg Flow Kit(FOXP3 Alexa Fluor 488/CD4 APC/CD25 PE),核内指标检测，需要破双层膜，固定,/,破膜剂不同于胞内指标使用的试剂！,FOXP3 Fix/Perm Buffer(4x,),(#421401),FOXP3 Perm Buffer(10 x),(#,421402),43,如何节约您的时间？,胞内检测流程,:,需要大约,1,天,表面,指标检测,固定,/,破膜,胞内指标检测,刺激活化,细胞活化,固定,破膜,检测,表面,+,胞内指标,室温孵育抗体优于,4C,检测指标下调,如：,CD4,BioLegend Fixation,buffer(#420801),Cyto-Last Buffer,(#422501),4C,可保存至,2,周,哪些步骤可以保存及暂停实验？,44,固定,/,破膜后染色检测需注意！,固定,/,破膜对表面指标的影响：,Krutzik et al.JI 2005,45,五,.,流式多色,Panel,设计,46,带有不同荧,光素的细胞,细胞表面受体,针对细胞不同蛋白的标记,不同荧光素单克隆抗体,细胞与多种抗体共孵育,流式多色检测概述,1.,1.,多个激发光，滤光片，,PMT,2.,选择多种流式试剂,47,更加准确区分某一特定细胞群,多种参数，获得更多信息,省时，省钱，省标本,有助于发更好的文章,流式多色检测的优势,Th1,随着科学的发展，细胞的标记在不断发现，数量在不断增加！,所以在区分某一特定细胞群时,需要更多的细胞标记。,48,需要功能强大的流式细胞仪,荧光素选择更加困难,补偿难调节,流式多色检测的难点,49,流式多色,Panel,设计,第一步：了解您的流式仪器配置,型号,激发光，探测器，滤光片,第二步：荧光素与流式仪器相匹配,第三步：检测指标与荧光素相匹配,第四步：,查找,&,订购商业的荧光素抗体,50,流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及,流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及,分析型流式，科研临床领域都涉及,分析型流式，有几种型号，临床领域为主,Attune,分析型流式，科研领域为主,分析型流式，科研领域为主,第一步：了解您的流式仪器配置,51,FACS Calibur,单激光三色，或双激光四色，市场覆盖率最高，分析型,FACS Canto,双激光,六,色，分析型,FACS Aria,双激光,六,色，或三激光,八,色，分选型为主，也可以分析,FACS LSR,双激光,六,色，三激光,八,色，或者更多激光，分析型最高配,FACS Influx,激光多个，高端分选型,BD,流式细胞仪,52,Canto,and ARIA typical,光路图,488 nm,405 nm,633 nm,53,检测器组（激光器）,PMT,位置,长通透镜,带通,/,长通透镜,适用染料,八角形,A,735,780/60,PE-Cy7,（,488nm,蓝色激光）,B,655,670 LP,PerCP-Cy5.5,PerCP,C,610,空白可选框,-,D,556,585/42,PE,E,502,530/30,FITC,F,空白可选框,488/10,SSC,G,空白可选框,空白可选框,-,H,空白可选框,空白可选框,-,三角形,A,502,510/50,Amcyan,BV510,（405nm),紫色激光）,B,空白,540/50,PacificBlue,BV421,三角形,A,735,780/60,APC-Cy7,（,633nm,红色激光）,B,685,空白可选框,C,空白,660/20,APC,BD Canto,光路参数,例 如：,54,检测器组（激光器）,PMT,位置,长通透镜,带通,/,长通透镜,适用染料,八角形,A,735,780/60,PE-Cy7,（,488nm,蓝色激光）,B,655,670 LP,PerCP-Cy5.5,PerCP,C,610,空白可选框,-,D,556,585/42,PE,E,502,530/30,FITC,F,空白可选框,488/10,SSC,G,空白可选框,空白可选框,-,H,空白可选框,空白可选框,-,三角形,A,502,510/50,Amcyan,BV510,（405nm),紫色激光）,B,空白,450/50,PacificBlue,BV421,三角形,A,735,780/60,APC-Cy7,（,633nm,红色激光）,B,685,空白可选框,C,空白,660/20,APC,BD Canto,光路参数,第二步：荧光素与流式仪器相匹配,55,通常根据抗原的表达情况，可将其分为三大类：,一类抗原：此类抗原高表达，且平行,Panel,中表达量变化不大,.,如：,CD3,CD4,CD8,CD56,CD11c,等，通常选择弱荧光素：,Pacific Blue,APC-Cy7,Alexa Fluor 700,BV785,等,二类抗原：这类抗原是表型分型所必须的，平行,Panel,中表达量是变化的，,如：活化的抗原，细胞因子等，通常选择中强荧光素：,如：,BV510,，,BV650,，,FITC,PerCP-Cy5.5,，,BV570,等,三类抗原：抗原表达量非常低，或是我们根本不知道的抗原表达情况，,而且通常仅能找到纯化抗体或是有限的几种荧光素标记。通常选,择最强的荧光素：,BV421,，,PE,，,APC,BV605,，,Alexa Fluor 647,等,第三步：检测抗原与荧光素相匹配,例如：,Th1/Th2/Th17/Treg,检测,CD3,，,CD4,；,IFN-r,，,Foxp3,；,CD25,，,IL-4,IL-17A,56,强表达抗原，选弱荧光素，也可选择强荧光素,弱表达抗原，一定要选强荧光素,常,用,的,荧,光,素,强,度,1.,弱表达抗原，一定选择最强的荧光素；,如果您对所检测的抗原表达量不清楚，,对于,Panel,内重要的抗原选择最强的荧光素；,57,58,人免疫细胞表面常用,Marker,的表达量,59,荧光素,亮度,检测抗原表达量,背景,优先使用频率,BV421,5,最低,最高,Pacific Blue,1,中到高,高,FITC/AF488,3,低到中,渗出到,PE,高,APC/AF647,5,低到中,高,BV570,4,中,渗出到,PE,和,BV421,中,Percp-Cy5.5,3,中,Crossbeam,到,AF700,中,PE,5,低到中,中,AF700,2,中到高,中,PE-Cy7,4,低到中,渗出到大部分,PE,的耦合荧光素及,Crossbeam,到,APC-Cy7,中到低,V500,1,很高,低,PE-Cy5,5,低,Crossbeam,到,APC,和渗出到,PE,和,Percp-Cy5.5,低,APC-Cy7,2,中,渗出到,APC,低,Pacific Orange,1,很高,很低,PE-TR,2,中,渗出到,PE,和,PE-Cy5,很低,荧光素亮度不是选择的唯一标准,60,荧光素,荧光强度,BV421,5,PE,5,APC,5,BV510,4,PE,-Cy7,4,Percp,-Cy5.5,3,FITC,3,APC,-Cy7,2,BD Canto,8,色,耦合荧光素：如：,Percp-Cy5.5,PE-Cy7,，,APC-Cy7,等，对光及固定剂稳定性差：,Percp-Cy5.5,对乙醇固定敏感,APC-Cy7,对多聚甲醛固定敏感,耦合荧光素固定后，光谱可能发生改变,2.FITC,对较低的,PH,敏感,3.APC&PE,不能冻存,例 如：,61,Th1/Th2/Th17/Treg,检测,例 如：,仪器：,BD Canto,检测器组（激光器）,长通透镜,带通,/,长通透镜,适用染料,八角形,735,780/60,PE-Cy7,（,488nm,蓝色激光）,655,670 LP,PerCP-Cy5.5,PerCP,610,空白可选框,-,556,585/42,PE,502,530/30,FITC,空白可选框,488/10,SSC,空白可选框,空白可选框,-,空白可选框,空白可选框,-,三角形,502,510/50,Amcyan,BV510,（405nm),紫色激光）,空白,450/50,PacificBlue,BV421,三角形,735,780/60,APC-Cy7,（,633nm,红色激光）,685,空白可选框,空白,660/20,APC,检测指标：,CD3,，,CD4,，,IFN-r,，,IL-4,Foxp3,，,CD25,，,IL-17A,Panel,：,Index,Fluorescein,CD3,BV510,CD4,PerCP/Cy5.5,CD25,BV421,FoxP3,AF647,IL-4,PE-Cy7,IFN-r,FITC,IL-17A,PE,Live/dead,Zombie NIR Fixable Viability Kit,62,10 color full panel example,指标,荧光素,CD3,AF700,CD4,PE-Cy5,CD8,Qdot 605,CD45RA,PE-Cy7,CD45RO,AF488,IL-4,PE,IFNg,BV570,IL-2,APC,IL-17a,BV421,63,第四步：,查找,&,订购商业的荧光素抗体,公司网站搜索：,BioLegend,：,Aqua,，,Zombie NIR,Zombie Yellow,先固定细胞，在进行流式抗体染色,Zombie Aqua,，,Zombie NIR,Zombie Yellow,先进行流式抗体染色，再固定细胞,Zombie Aqua,，,Zombie NIR,Zombie Yellow,做胞内流式检测,Zombie Aqua,，,Zombie NIR,Zombie Yellow,68,TruStain FcX(anti-mouse CD16/32),#101319,human TruStain FcX,#422301,去除非特异荧光信号,FcR,封闭,如：单核细胞，,B,细胞，,DC,细胞，,NK,，巨噬细胞，粒细胞，肿瘤细胞等高表达,FcR,，在检测这些细胞时，会出现假阳性或假阴性的结果：,69,样本管,加入正常抗体,同型对照,加入同型抗体,阴性对照,加,PBS,抗体,FC,段非特异性结合位点（普遍存在）,检测抗原位点,荧光组成,1,、细胞自发荧光,2,、非特异性标记荧光,3,、特异性标记荧光,荧光组成,1,、细胞自发荧光,2,、非特异性标记荧光,荧光组成,1,、细胞自发荧光,对照的设置,70,同型对照,为什么要设同型对照,?,用于消除由于抗体非特异性结合,到细胞表面的,Fc,受体及静电结,合而产生的背景染色,.,如何选择同型对照,?,与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型,与染色的单克隆抗体,相同种属来源,相同免疫球蛋白及亚型,相同荧光素标记,相同剂量和浓度,例如,:,标记,FITC,的单克隆抗体为小鼠,IgG1,亚类抗体，标记,PE,的单克隆抗体为小鼠,IgG2a,亚类抗体，同型对照应选用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化,IgG1-FITC,和,IgG2a-PE.,71,FMO,对照及门的设置,Full panel,IFNg unstim,FMO IFNg BV570,Full panel,IL-2 unstim,FMO IL-2 APC,Full panel,IL-4 unstim,FMO IL-4 PE,Full panel,IL-17a unstim,FMO IL-17a BV421,Antibody,Clone,Dilution,IL-17a BV421,BL168,1:50,Live/Dead Aqua,IFNg BV570,4S.B3,1:20,CD8 QD605,LT8,1:100,IL-4 PE,MP4-25D2,1:5,CD45RO AF488,UCHL1,1:5,CD45RA PE-Cy7,HI100,1:10,CD4 PE-Cy5,RPA-T4,1:5,IL-2 APC,MQ1-17H12,1:10,CD3 AF700,UCHT1,1:50,FMO,荧光扣除对照,（,Fluorescence Minus One,）,72,荧光补偿调节,荧光溢出,73,CD44 PE-Cy5,补偿微球,CD44 PE-Cy5,单荧光对照,?,补偿对照,:,细胞,vs.,补偿微球,74,荧光补偿调节,75,足够大的电压，才能将阴性阳性区分开,如果电压过高，不但不能得到更好的结果，反而会加大背景噪音,补偿是受电压影响的，电压不同，补偿会不同,PE,SSC,电压,PMT,电压,76,荧光补偿调节,例如：,FITC,与,PE,荧光补偿的调节,从,PE,通道中去除,FITC,的荧光信号：,1.,检测两管样品：,空白管,;,FITC,单标管,2.,调节补偿（,PE-%FITC),使得两群,细胞,FL2,的,Mean,值相同,相同的,Mean,值,77,荧光补偿调节,例如：,FITC,与,PE,荧光补偿的调节,从,FITC,通道中去除,PE,的荧光信号：,1.,检测两管样品：,空白管,;PE,单标管,2.,调节补偿（,FITC-%PE),使得两群,细胞,FL1,的,Mean,值相同,相同的,Mean,值,78,补偿不足及过补偿,补偿不足,过补偿,FITC,PE,79,谢谢,!,Email:,tech,80,