蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质双向电泳及质谱技术,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第1页,蛋白质双向电泳技术,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第2页,双向电泳介绍,2-DE,是当前唯一个能够仅经过一次操作解析上千种蛋白质技术。,第一向,等点聚焦,(IEF),pH,梯度载体,pI,第二向,十二烷基硫酸钠,-PAGE(SDS-PAGE),SDS,作为变性剂和助溶剂,分子量,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第3页,样品,等点聚焦,(,第一向,),双向电泳基本原理与流程示意,分子量,pH,梯度,(pI),SDS-PAGE,两性电解质,pH 9,-,pH 3 +,聚丙烯酰胺,第二向,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第4页,双向电泳详细步骤,样品制备,缓冲液配制,IPG,条重泡涨及上样,第一向：,IEF,IPG,条平衡,平衡缓冲液,(,还原,),平衡缓冲液,(,巯烷基化,),第二向：,SDS-PAGE,胶条染色,成像及图像分析,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第5页,为何要进行样品制备,当前双向电泳普通只能分辨到,1000-3000,个蛋白质点,(spot),，而样品中蛋白种类可到达,10,万种以上。,待研究样本,(,如临床样本,),常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究通常是单一细胞类型。,？,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第6页,1,确保样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰原因少,尽可能使全部待分析蛋白样品全部处于溶解状态（包含多数疏水性蛋白）。,防止样品制备过程中发生样品抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。,完全去除样品中核酸和一些干扰蛋白,。,尽可能去除起干扰作用高丰度或无关蛋白，从而确保待研究蛋白可检测性。,经过超离心去除全部颗粒状物质，预防其堵塞凝胶孔路。,2,最大程度降低样品损失,低温保留样品,(,普通需低于,-86),尽可能缩短处理时间,除盐，省略无须要过程,确保样品在聚焦时不发生蛋白聚集和沉淀。,样品制备标准,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第7页,样品制备流程及注意事项,溶解,预处理,(,清洗等,),破碎,沉淀,按溶解度分级,富集,除杂,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第8页,样品破碎,标准最小程度降低蛋白水解和其它形式蛋白降解,样品起源,易碎细胞,坚硬组织,植物细胞,真菌,方法,温和,猛烈,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第9页,温和破碎法,渗透压冲击,(,培养细胞,),低渗液中悬浮细胞,重复冻融法,(,细菌,),液氮冷冻,去污剂降解,(,酵母、霉菌,),降解缓冲液,(,含尿素和去污剂,),SDS(,应在,IEF,前往除,),酶降解,(,植物、细菌、真菌,),溶菌酶,(,细菌,),纤维素酶，果胶酶,(,植物,),溶壁酶,(,酵母,),蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第10页,猛烈破碎法,超声破碎,(,细胞悬浮液,),需以冰凉却防止过热,弗式细胞压碎器,(,French pressure,cell,，带壁微生物,细胞在剪切力作用下破碎,研磨,(,固体组织，微生物,),液氮中将固体组织磨成细粉末,样品研磨器,(,用于少许样品处理,),用于准确样品,珠磨法,(,胞悬液，微生物,),经过磨珠研磨破坏细胞壁,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第11页,作用,去除杂质,浓缩样品,抑制蛋白酶活性,关键,-,可溶性,取得能够重新溶解蛋白,惯用方法,硫酸铵沉淀,TCA,沉淀,丙酮沉淀,TCA/,丙酮沉淀,醋酸铵,/,甲醇,/,苯酚抽提,样品沉淀,对于疏水性尤其强蛋白如膜蛋白,硫脲,SDS,新型两性表面活性剂,(,如磺基甜菜碱,),蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第12页,样品中杂质去除,去除标准,尽可能不丢失蛋白,降低蛋白修饰,杂质主要种类,DNA/RNA,脂质,多糖盐,离子去污剂,其它固体杂质,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第13页,DNA/RNA,去除,样品中含核酸不利影响,能被银染色法染色,在凝胶酸性部分产生水平条纹,当样品抵达,IEF,凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀,去除方法,蛋白沉淀法,DNase/RNase,处理,超声,(,机械破坏,),、超高速离心,DNA/RNA,抽提,(,苯酚,/,氯仿,),蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第14页,其它杂质去除,脂质,使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及,pI,丙酮沉淀,多糖,阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦,TCA,、硫酸铵或醋酸铵,/,甲苯,/,苯酚沉淀；超速离心和高,pH,盐,使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生,透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮,离子去污剂,如,SDS,，使蛋白质带负电不能聚焦,丙酮沉淀；将含,SDS,蛋白溶于含两性或非离子去污剂如,CHAPS,，,Triton X-100,，,NP-40,等缓冲液中并使,SDS,终浓度,0.25%,固体杂质,阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦,过滤,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第15页,样品溶解,2-DE,成功分离蛋白质最关键原因之一,溶解目标,样品中非共价结合蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽溶解液（不然样品中结合牢靠蛋白复合物可能使,2-DE,中出现新蛋白点，对应表示单个多肽点强度会下降）,溶解方法必须允许可能干扰,2-DE,分离盐、脂类、多糖和核酸等物质去除,溶解方法要确保样品在电泳过程中保持溶解状态,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第16页,增加样品溶解性伎俩,变性剂,改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展,尿素、硫尿,表面活性剂,溶解疏水基团,离子去污剂,SDS,、非离子去污剂,Triton X-100,和,NP-40,、两性离子去污剂,CHAPS,等,还原剂,使变性蛋白深入伸展溶解,含自由巯基,DTT,或,-,巯基乙醇，不带电荷磷酸三丁酯,(TPB),起载体作用两性电解质,抵达平衡位置形成,pH,梯度，“运载”电流、,pH,捕捉样品中少许盐分,浓度应小于,0.2,（,w/v,，浓度过高会使,IEF,速度降低,),蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第17页,样品液准备,标准液,：,2g,4%CHAPS,定容至,50mL,ddH,2,O,100uL 0.1%,原液,0.0002%,溴酚蓝,见下表,0.2%,两性电解质载体,385mg DTT,或,500uL 200mM TBP,原液,50mM DTT,或,2mM TBP,24g,尿素加入,25mL H2O,8M,尿素,用量,试剂,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第18页,IPG,用两亲性电解液组成,250,l,25,l,20%,8-10,125,l,12.5,l,40%,7-9,7-10,250,l,25,l,40%,5-8,5-8,125,l,12.5,l,40%,4-6,250,l,25,l,40%,3-5,3-6,125,l,12.5,l,40%,5-7,125,l,12.5,l,40%,4-6,4-7,250,l,25,l,40%,3-10,3-10,样品溶液体积,(/5ml),样品溶液体积,(/5ml),两亲性电解液浓度,(w/v),两亲性电解液范围,IPG,胶,pH,范围,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第19页,样品制备注意事项,蛋白质水解,低温,Tris,碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质,蛋白抑制剂,特殊样品制备,低丰度蛋白分离,预分级,窄,pH,胶,(2,个,pH,单位,),强碱性蛋白,(,如核糖体,),处理,预处理富集,特殊,pH,梯度,IPG,胶条（如,pH3,12,、,4-12,或,10-12,）进行等电聚焦,极端分子量蛋白处理,小于,8kD,对流混合，产生绒毛状或含糊带,大于,200kD,蛋白，变性为多肽,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第20页,梯度器,塑料支持膜,固定,pH,梯度,(Immobilized pH,Gradient,IPG,),胶条制备,A,C,B,F,E,D,酸,碱,pH 3,pH 10,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第21页,固定,pH,梯度,(IPG),示意图,聚丙烯酰胺凝胶,CH,2,=CH-C-NH-R,O,COO,-,丙烯酰胺单体,酸缓冲基团：,碱缓冲基团：,NH,3,+,R,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第22页,宽,pH,梯度及窄,pH,梯度,宽,pH,梯度用于：,全部蛋白,(,确定感兴趣蛋白大致位置,),窄,pH,梯度用于：,提升分辨率,增加载样能力以检测、分析更多蛋白,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第23页,IPG,胶重泡涨及上样,2-DE,样品,重泡涨溶液,重泡涨溶液：,8M,尿素,2%NP-40,或,CHAPS,2%IPG,缓冲液,(,两亲性电解液,),0.28%DTT,微量,溴酚蓝,IPG,胶条支架,IPG,胶条,定位,泡涨目标：使样品能完全以可溶形式进入,IPG,胶条内,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第24页,蛋白载样量,IPG,胶条对蛋白载样量影响原因：,待分析蛋白点量应满足随即质谱分析待研究蛋白丰度,样品复杂度,复杂度较高样品，为了尽可能了解所包含每种蛋白，需要重复试验才能完成。假如将待检样品被富集以后则更易分析。,IPG,胶条,pH,范围,预试验确定,先宽后窄,先线性后非线性,先短后长,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第25页,第一向：等点聚焦,1.,放置电极垫,(?),2.200 V,维持,1.5h,3.500 V,维持,1.5h,4.1000 V,梯度上升,1500vh,5.8000 V,梯度上升,(?)36000vh,时间,电压,支架盖,IPG,胶条,电极,电极垫,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第26页,IPG,胶条平衡,平衡液,6 M,尿素和,30%,甘油,降低电内渗,第一步平衡,加,DTT,使变性非烷基化蛋白处于还原状态,第二步平衡,加碘乙酰胺,使蛋白质巯烷基化，预防其在电泳过程中重新氧化,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第27页,使被分离蛋白质与,SDS,完整结合,第二向,:,SDS-PAGE,SDS,平衡,SDS-PAGE,SDS,平衡液,50 mM Tris-HCl,6 M,尿素,30%,丙三醇,2%SDS,微量,溴酚蓝,SDS,SDS-PAGE,SDS-PAGE,向电泳缓冲液中加,0.5%,琼脂糖,SDS-PAGE,标识纸片,IPG,胶条,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第28页,胶体考马斯亮蓝染色,灵敏度为,30100ng,，线性范围是,20,倍,可实现,PAGE,无背景染色,会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析结果,胺基黑染色,转印至聚偏二氟乙烯（,PVDF,）上蛋白质染色,转印至硝酸纤维素膜上蛋白质染色,银染,可降低胶内蛋白质产量,对一些种类蛋白质染色效果差,对其后蛋白质测序和质谱分析造成影响,染色方法,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第29页,银染色,50%,甲醇,25%,乙酸,4h,ddH,2,O,洗,3,次,30min/,次,0.004%DTT,溶液,30min,0.1%AgNO,3,30min,ddH,2,O,30 sec,3%Na,2,CO,3,0.0185%,甲醛,2.3M,柠檬酸,5%,乙酸,25%,甲醇,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第30页,负染,主要包含金属盐染料、锌咪唑染料等使用,能专门提升,PAGE,胶上蛋白质回收率,速度快（,515min,）且能保持蛋白质生物活性,不能用于膜上染色,适合用于蛋白质显色、完整蛋白质胶上被动提取以及质谱分析,胶体扩散染料,主要包含印度墨水染料、胶体金属染料等,高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和,PVDF,膜上蛋白质,灵敏度与,PAGE,胶内银染类似,不用于胶内染色,染色方法,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第31页,有机荧光团染料,包含共价结合和非共价结合荧光团染料两类，后者最为惯用，其经典代表是已经商品化,SYPRO Red,、,Orange,、,Ruby,等荧光染料,可对,SDS-PAGE,胶内蛋白质进行一步染色，约,3060min,完成,灵敏度为,210ng,其线性范围为,3,个数量级,在,Tris/,甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或,Edman,测序来判定蛋白质,金属螯合染料,与当代蛋白质组学研究相兼容,专门与惯用微量化学表征过程兼容,不包含戊二醛、甲醛或,Tween-20,等，很轻易和集成化蛋白质组学平台（包含自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合,染色方法,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第32页,凝胶图像处理分析,经典流程,凝胶图像扫描,图像加工,斑点检测和定量,凝胶配比,数据分析,数据呈递和解释,2-DE,数据库建立,2-DE,分离可溶性,E.coli,蛋白,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第33页,当前双向电泳需处理问题,样品制备及溶解,不溶性蛋白,(,膜蛋白及核内蛋白,),难分离蛋白,(,如毛发及皮肤中蛋白,),载样量提升,初步分离,低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白,定量分析,灵敏度及可重复性,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第34页,对于双向电泳提议,首先采取宽,pH,范围胶条，确定蛋白分布范围，通常采取,pH3-10,胶条,假如,pH,线性分布胶条分离效果不好，可采取非线性胶条,加大蛋白上样量，提升局部蛋白分辨率,采取窄,pH,范围胶条，提升某,pH,范围蛋白分辨率,第二向采取梯度胶进行分离,去除高丰度蛋白，进行蛋白分级处理，富集低丰度蛋白,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第35页,蛋白质质谱技术,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第36页,质谱基础,样品,离子源,质量分析器,离子检测器,固体,液体,蒸汽,形成离子,(,带电分子,),电离,质量分选,(,过滤,),检测,依据,m/z,分选离子,数据处理,质谱,检测离子,基本步骤,:,1.,样品离子化,2.,依据质量,(m/z),不一样分离离子,3.,检测每种质量离子数目,4.,搜集、处理数据得到质谱图,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第37页,质谱评价指标,质量范围,速度,灵敏度,分辨率,准确度,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第38页,+,+,+,自由漂移区,检测器,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,(MALDI-TOF-MS),样品探针,激光,335 nm,m/z,相对强度,MH,+,MH,+,MH,+,特点：,灵敏度高,准确度高,分辨率高,质量范围广,图谱简明,速度快,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第39页,ESI,四级杆质量分析器,碰撞室,反射器,MCP,检测器,碰撞气体,串联质谱法,(MS/MS),ESI-Q-TOF,质谱仪,步骤：,1,质量分析,2,碰撞,(,离子裂解,),3,质量分析,TOF,质量分析器,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第40页,强抗背景干扰能力,极高检测灵敏度和准确,度,可用来分析复杂混合物中蛋白质,丰富检测信息,，,高通量判别蛋白质,串联质谱优点,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第41页,1,、,判定和注释蛋白质路线,经过肽质谱指纹图（,peptide mass fingerprinting,，,PMF,）和数据库搜寻匹配,经过串联质谱进行单个或多个蛋白质判定,鸟枪法蛋白质组学,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第42页,1234.5396,783.9147,375.2561,多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据,MALDI-TOF,检测多肽指纹,胰酶消化,凝胶,蛋白质,数据库,?,1,2,3,比较,:,?,是否相同,?,质谱,3235.2256,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第43页,肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功可能原因,样品量太少，,PMF,图信噪比太低，输入库中搜寻数据质量不好。,2-DE,胶上所取一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获,PMF,图实际上是两个以上蛋白质混合图。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第44页,操作中角蛋白或其它蛋白质污染,蛋白质发生了较多转译后修饰，数据库中未有记载,所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多,未知新蛋白质,数据库规模太小,续：,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第45页,氨基酸序列,VLD,PNT,VFAL,蛋白质数据库,？查询,串联质谱图,从头测序,输入,输出,序列片段,PNT,串联质谱判定多肽计量方法,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第46页,组织切片或印片原位质谱分析技术,两级飞行时间串联质谱（,MALDI-TOF/TOF,）,傅里叶转换盘旋共振质谱（,FTMS,）,表面增强激光解吸,/,电离飞行时间质谱（,SELDI-TOF-MS,）,联合技术准确判定蛋白质,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第47页,2,、基于生物质谱定量蛋白质组研究策略,原理：,对于含有相同离子化能力蛋白质或多肽，能够经过比较质谱峰强度（或峰面积）得到待比较蛋白质相对量。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第48页,3,、基于质谱蛋白质相互作用研究方法,靶蛋白制备,蛋白质复合体纯化,蛋白质,复合体,质谱判定,基本步骤：,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第49页,(1),亲和层析耦联质谱技术,基本原理：,将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用蛋白质细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合蛋白质，然后用高盐溶液或,SDS,溶液洗脱结合在柱子上蛋白质，最终用多维液相色谱耦联质谱技术（,MDLC-ESI-MS/MS,）判定靶蛋白结合蛋白。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第50页,先决条件,得到足够多保持生物活性重组靶蛋白作为诱饵（,bait,）,取得足够量、纯度高与诱饵相互作用蛋白质,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第51页,利用含靶蛋白融合蛋白取得相互作用蛋白质,谷胱甘肽,S,转移酶（,glutathione S-transferase,，,GST,）融合蛋白,蛋白,A,融合蛋白,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第52页,主要优点,灵敏度高：高浓度靶蛋白,候选蛋白质与靶蛋白结合机会均等,检测多亚基蛋白质之间相互作用,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第53页,(2),免疫共沉淀耦联质谱技术,原理：,以细胞内源性靶蛋白为诱饵,，,用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀,（,immuno-precipitation,，,IP,）,纯化靶蛋白免疫复合物,，,凝胶电泳分离后,，,质谱判定靶蛋白结合蛋白。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第54页,研究鼻咽癌细胞系中,p53,相互作用蛋白,抗,p53,抗体与,HNE1,和,HNE2,总蛋白进行免疫共沉淀,SDS-PAGE,分离免疫沉淀复合物,切取,p53,结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（,LC-ESI-MS/MS,）分析，得到对应肽序列标签,搜索数据库,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第55页,特 点,生理条件下蛋白质之间相互作用,全部蛋白质与靶蛋白相互作用,可检测依赖于修饰蛋白质相互作用,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第56页,局 限 性,A.,灵敏性不高,B.,假阳性,C.,受免疫球蛋白干扰较大,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第57页,Biacore,基于,表面等离子共振,(SPR,),进行生物大分子相互作用分析,(BIA),质谱,(MALDI-TOF-MS,或,LC-ESI-MS/MS,),判定,Biacore,芯片上配体所捕捉生物分子,(3),生物传感器耦联质谱技术,组 成,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第58页,Biacore,基本工作原理,当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）时会引发作用表面,(,芯片,),折射率改变，这种光信号可被光感受器接收并转换成电信号传送到计算机，再由计算机还原为模拟生物信号。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第59页,(4),串联亲和纯化耦联质谱技术,基本原理：,在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标识（,TAP Tag,），经过特异性两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到蛋白质复合体进行判定。,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第60页,主要流程,双重分子标签构建到靶蛋白,表示融合蛋白,制备细胞裂解液,IgG,柱纯化,TEV,蛋白酶洗脱液洗脱蛋白质复合体,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第61页,耦联钙调素亲和柱纯化,洗脱,含,EGTA,洗脱液洗脱,质谱判定结合蛋白质,续：,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第62页,特 点,取得生理条件下与靶蛋白相互作用蛋白质,判定出在空间上非直接物理相互作用蛋白质,适合用于大规模蛋白质相互作用研究,蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座,第63页,