动物胚胎移植技术及体外受精.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,动物胚胎移植技术及体外受精,动物胚胎移植技术及体外受精,第1页,当代生物技术,家畜育种领域,繁殖生物技术,分子生物技术,人工授精技术,胚胎工程技术,超数排卵和胚胎移植,胚胎性别判定,体外受精,胚胎分割,克隆技术,动物胚胎移植技术及体外受精,第2页,试管婴儿,体外受精联合胚胎移植技术（,IVF,）,1978,年英国教授,steptoe,和,Edowrds,定制了世界上第一个试管婴儿,1978,年,7,月,25,日世界第一例试管婴儿,Louis Brown,在英国诞生。,IVF,最早阶段妊娠成功率只有,2.94,。,大陆首例试管婴儿郑萌珠于,1988,年,3,月,10,日早晨,8,点,56,分在北京医科大学第三医院诞生,动物胚胎移植技术及体外受精,第3页,第一节 胚胎工程技术,胚胎移植,胚胎融合,胚胎分割,胚胎冷冻保留,早期胚胎培养,胚细胞核移植,动物胚胎移植技术及体外受精,第4页,动物胚胎移植技术及体外受精,第5页,受精过程 分解放射冠卵泡细胞 水解局部透明带 精子细胞核和个别胞质进入卵母细胞,动物胚胎移植技术及体外受精,第6页,动物胚胎移植技术及体外受精,第7页,动物胚胎移植技术及体外受精,第8页,卵裂及胚泡形成,（第一周）,卵裂,(cleavage),受精卵由输卵管向子宫方向运行，并不停进行细胞分裂，受精卵早期细胞分裂称,卵裂,；卵裂产生子细胞呈球形，称,卵裂球,（,blastomere,）,桑椹胚,（,morula,）,受精后第,3,天，形成了,1216,个卵裂球组成实心胚，形似桑椹，称桑椹胚,动物胚胎移植技术及体外受精,第9页,胚泡形成,受精后,第,46,天,桑椹胚细胞继续分裂，细胞间开始出现小腔隙，并逐步汇合成一个大腔，桑椹胚转变为中空泡状，,称胚泡,（,blastocyst,），,胚泡由三个别组成：,胚泡,滋养层,胚泡腔,内细胞群,极端滋养层,动物胚胎移植技术及体外受精,第10页,一、胚胎移植,受精卵移植,把一头雌性动物早期胚胎从输卵管或子宫中冲洗出来，移植到另一头雌性动物输卵管或子宫内，使之继续发育成新个体技术,供体,提供胚胎动物,受体,接收和孕育胚胎动物,动物胚胎移植技术及体外受精,第11页,初始阶段,1890-1900 W.Heape,将安哥拉兔和荷兰兔受精卵分别移植到比利时兔输卵管内，分别取得仔兔,2,只,1900-1950,主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率,35%,左右,发展阶段,1950-1970,日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采取非手术法移植成功，胚胎移植成功率达,70-80%,胚胎移植历史,动物胚胎移植技术及体外受精,第12页,实用化初始阶段,1970-1980,加美开始成立牛胚胎移植企业，,1973,年牛冻胚移植成功（英）,实用化研究阶段,1982-,大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别判定、体外受精在英美日德广泛开展，克隆羊诞生,胚胎移植历史,动物胚胎移植技术及体外受精,第13页,动物胚胎移植技术及体外受精,第14页,1.,胚胎移植生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期卵泡发育和排卵数可达数十个,每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育,早期胚胎处于游离状态,胚胎发育不存在免疫问题,胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织联络,胚胎遗传性不受受体影响,动物胚胎移植技术及体外受精,第15页,2.,胚胎移植基础标准,胚胎移植前后所处环境同一性,供体和受体在分类学上相同属性,动物生理上一致性：受体和供体在发情时间上同期性,动物解剖位置上一致性：空间环境一致性,胚胎发育期限：,必须处于周期黄体期内,胚胎质量：,胚胎必须是正常，并在处理过程中不受不良原因影响,动物胚胎移植技术及体外受精,第16页,3,、胚胎移植,供受体选择与管理,供体超数排卵处理和配种,受体同期发情处理,胚胎回收,胚胎检验,胚胎移植,动物胚胎移植技术及体外受精,第17页,1,）供受体选择与管理,供体选择,遗传价值：生产性能优异母畜,健康情况,:,身体健康，营养水平中等以上未孕动物,繁殖性能：到达配种年纪以上繁殖机能正常母畜,动物胚胎移植技术及体外受精,第18页,受体选择,身体健康，身体情况中上适繁未孕个体，无生殖道疾病和难产病史,繁殖情况正常，有正常发情周期,母性良好：泌乳性能、护仔性能,供、受体管理,防疫、统计,喂养管理等,动物胚胎移植技术及体外受精,第19页,2,）同期发情（,synchronization of eatrus,）,采取激素或类激素药品处理，使这一群母畜在特定时间内集中发情和排卵,即将母畜黄体期延长或缩短，使母畜摆脱内、外孕激素对卵巢控制，在同一时间内引发全部母畜卵泡发育，从而到达同期发情目标,动物胚胎移植技术及体外受精,第20页,延长黄体期：孕激素,控制卵泡生长发育和发情表现,缩短黄体期：前列腺素,加速黄体退化，使卵巢提前摆脱体内孕激素控制,促进卵泡发育、排卵：促性腺激素,动物胚胎移植技术及体外受精,第21页,3,）超数排卵,超排,：以各种外源性促性腺激素诱发动物卵巢许多卵泡发育并排出含有受精能力卵子,孕母马促性腺激素、促卵泡素、,前列腺素、促排卵类药品、孕激素,超数排卵处理时期应选择在发情周期后期，即黄体消退时期,动物胚胎移植技术及体外受精,第22页,个体对超排处理反应效果难以预测,产生不良后果：胚胎死亡,卵母细胞蛋白质合成过程发生改变,生殖道机能产生影响,动物胚胎移植技术及体外受精,第23页,4,）胚胎回收,利用冲胚液从供体生殖道中冲洗出来，提供移植或其它胚胎工程用,手术法,非手术法,动物胚胎移植技术及体外受精,第24页,动物胚胎移植技术及体外受精,第25页,动物胚胎移植技术及体外受精,第26页,胚胎质量评价：,透明带形态和完整性,胚胎发育与胚龄是否一致,胚胎形态与匀称性，胚内细胞大小改变,细胞质结构及颜色，胚内是否出现空泡，细胞碎片，有没有游离细胞,如,A,级：,为优良胚胎，形态经典，卵裂球轮廓清楚，紧密充实，大小均一，细胞质致密，色调和分布均一,动物胚胎移植技术及体外受精,第27页,6,）胚胎保留,胚胎降温：使胚胎停顿发育，延长其体外生存时间,体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育,胚胎冷冻：经过一定处理程序，将胚胎降温冷冻后，保留于液氮中,动物胚胎移植技术及体外受精,第28页,胚胎冷冻原理,胚胎冷冻实际是脱水过程，,冷冻保留关键是设法降低细胞内冰晶对胚胎损伤,冷冻过程中，水分形成冰晶造成细胞机械损伤，同时，造成未结冰细胞内溶液渗透压急剧升高，造成蛋白质变性，造成死胎,常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻保持,动物胚胎移植技术及体外受精,第29页,受精卵移植,普通供体为良种或优良个体，而受体为生产性能较差个体或品种。,“借劣质动物之腹怀优异个体之胎”,7,）胚胎移植,动物胚胎移植技术及体外受精,第30页,选择,供体母牛,受体母牛,同期发情处理,超数排卵,供体公牛,配种,冲卵,质量检验、培养,胚胎移植,妊娠检验,分娩（胚胎移植犊牛）,胚胎移植基础程序,动物胚胎移植技术及体外受精,第31页,8),胚胎移植应用范围,在家畜改良方面应用,在特定品种扩繁上应用,在动物生物多样性上应用,其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精,动物胚胎移植技术及体外受精,第32页,在家畜改良方面应用,人工授精技术可成几十到几百倍地提升了优异种公畜配种效能，但对优异母畜来说，受其产仔数和世代间隔限制，尤其是牛羊等繁殖力较低畜种更是如此,经过超数排卵和胚胎移植技术（,multiple ovulation and embryo transfer:MOET),牛羊生长性状年遗传进展可比正常繁殖提升,80%,和,70%,；产奶性状提升,33%,动物胚胎移植技术及体外受精,第33页,在特定品种扩繁上应用,牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要,7-8,个世代，,15-20,年，而采取,MEOT,法，一次就可取得一个纯种群体,80,年代初，美、澳、新从欧洲引进大型肉牛品种均采取胚胎移植技术扩繁,年前后，我国波尔山羊也是采取胚胎移植进行扩繁,动物胚胎移植技术及体外受精,第34页,在动物生物多样性上应用,在保护动物遗传资源，提升家畜生产性能，挽救濒临灭绝野生动物方面，胚胎移植技术越来越发挥出主要作用,冷冻能够很好地保留濒临灭绝动物胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体降低，也是这种动物胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功，如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛,动物胚胎移植技术及体外受精,第35页,其它方面应用,胚胎移植是克隆技术必须过程,体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿继续发育”,转基因及动物生物反应器研究也必须借助胚胎移植,动物胚胎移植技术及体外受精,第36页,二、胚胎分割技术,1,）,概念,采取,显微手术（机械方法）,方法将早期胚胎分割成,2,分胚，,4,分胚或,8,分胚，经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎技术,胚胎分割以增加优异遗传性状动物数量为主要目标，可提升胚胎移植技术效率和效益,动物胚胎移植技术及体外受精,第37页,选择良好桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体,2),基础过程：,动物胚胎移植技术及体外受精,第38页,动物胚胎移植技术及体外受精,第39页,动物胚胎移植技术及体外受精,第40页,3,）胚胎分割理论依据,大多数哺乳动物早期胚胎属调整发育类型，去掉早期胚胎二分之一，剩下个别仍发育成完整胚胎，,最少在,8,细胞前，每个分裂球都有相同发育能力,到,晚桑椹胚时,，胚胎发生初步分化，这时进行胚胎分割，能够重新发育到囊胚,动物胚胎移植技术及体外受精,第41页,4,）特点,:,后代含有相同遗传物质,胚胎克隆,5,）使用主要仪器：,实体显微镜和显微操作仪,6,）应用,:,为转基因技术、性别控制技术提供活胚材料,动物胚胎移植技术及体外受精,第42页,注意：,对囊胚阶段胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割,原因：内细胞团普通到囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身基础细胞，其它细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多个别正常发育能力强，少个别发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题,动物胚胎移植技术及体外受精,第43页,胚胎分割技术也是动物克隆方法之一,胚胎分割份数越多，操作难度会越大，移植成功率也越低,早期胚胎体积很小，只有在显微镜下才能看到,细胞数目是有限：分割份数越多，不但难以做到均等分割，每一份细胞数会越少，作为囊胚期胚胎内细胞团细胞所受影响会更大,分割份数越多，技术难度会越大，移植后恢复和发育难度会越大，移植成功率自然会降低,动物胚胎移植技术及体外受精,第44页,透明带对于分割胚体内外发育影响,透明带作用：阻止异种动物精子受精和同种动物多精子受精，保护受精卵在输卵管和子宫内正常运行，预防输卵管和子宫液伤害及白细胞吞噬，并使分裂阶段卵裂球相互靠近，不致分离,胚胎分割时所处发育阶段，对透明带依赖性越强,动物胚胎移植技术及体外受精,第45页,冷冻胚胎影响,分割过程引发透明带损伤和胚胎细胞数量降低，经冷冻和解冻在体内和体外发育能力深入降低，其移植妊娠率低于完整冷冻胚胎,动物胚胎移植技术及体外受精,第46页,三、胚胎嵌合体,由两个或两个以上含有不一样遗传性状细胞或细胞系组成聚合胚发育而成个体,原发性嵌合体,次生型嵌合体,动物胚胎移植技术及体外受精,第47页,1,、方法,囊胚注入法,在动物胚胎发育到囊胚时，将目标细胞或细胞团注入囊胚腔，使之与内细胞团结合并发育，最终得到嵌合体个体,动物胚胎移植技术及体外受精,第48页,聚正当,全胚聚正当,将发育到一定时期胚胎，去掉透明带后，将两个或两个以上胚胎聚合在一起，形成一个胚胎后放入二氧化碳培养箱中培养至囊胚，再植入受体动物体子宫内,卵裂球聚正当,去掉透明带后将胚胎打散，从双方胚胎卵裂球中各取出一个别细胞进行聚合，培养后移植动物胚胎移植技术及体外受精,第49页,2,、影响原因,胚胎质量与状态,A,级和,B,级胚胎,胚胎发育时期,多采取,8,细胞早期胚胎聚合,动物胚胎移植技术及体外受精,第50页,四、胚胎细胞核移植,将未着床早期胚胎分散成单个细胞，用电融合方法，使单个细胞与去除细胞核未受精成熟卵母细胞融合，体外培养发育成胚胎后，移入受体妊娠产子,已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等动物上成功,动物胚胎移植技术及体外受精,第51页,五、性别控制与胚胎性别判定,动物性别控制,(sex control),技术是经过对动物正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出大家期望性别后代一门生物技术,X,、,Y,精子分离技术：流式细胞仪,胚胎性别诊疗,动物胚胎移植技术及体外受精,第52页,早期胚胎性别判定,1,）核型分析：分析个别胚胎细胞染色体组成,2,）,SRY,片段,PCR,扩增,Y,染色体上特异片段,动物胚胎移植技术及体外受精,第53页,3,）,H-Y,抗原：雄性特异性弱组织相容性,Y,抗原,只有,Y,精子才能表示,H-Y,抗原,利用,H-Y,抗体检测精子质膜上存在,H-Y,抗原，再经过一定分离程序，就能将精子分离成,H-Y,+,(Y,精子,),和,H-Y,-,(X,精子,),两类，将所需性别精子进行人工受精，即可取得预期性别后代,测定胚胎上,H-Y,抗原存在是否对胚胎性别作出判定,动物胚胎移植技术及体外受精,第54页,意义,经过控制后代性别百分比，可充分发挥受性别限制生产性状,(,如泌乳,),和受性别影响生产性状,(,如生长速度、肉质等,),最大经济效益,控制后代性别百分比可增加选种强度，加紧育种进程,控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现异性孪生不育现象，排除伴性有害基因危害,动物胚胎移植技术及体外受精,第55页,六、早期胚胎培养,发育阻断：早期胚胎停顿在某个特定发育时期，不能继续发育,时间随动物种不一样而异,培养条件不完备,添加各种生长因子可促进胚胎发育,与一些体细胞共同培养,喂养性细胞，经过分泌一些有利于胚胎发育所需营养因子,动物胚胎移植技术及体外受精,第56页,第二节 体外受精,体外受精,(In Vitro Fertilization),是指哺乳动物精子和卵子在体外人工控制环境中完成受精过程技术，英文简称为,IVF,在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后取得动物称试管动物,(test-tube animal),动物胚胎移植技术及体外受精,第57页,人工授精,(AI),动物胚胎移植技术及体外受精,第58页,一、基础原理：,人工模拟体内环境（包含营养、温度、,pH,等），使初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精作用，并有计划地保留胚胎,动物胚胎移植技术及体外受精,第59页,二、体外受精技术发展历史,体外受精研究有,100,多年历史,1878,年德国,Sehenk,在家兔和豚鼠进行了尝试,1954,年张民觉取得首例体外受精兔,1963,年金黄仓鼠体外受精取得成功，开创了精子体外获能成功先例,1990,年我国钱菊芬取得首例试管山羊,旭日干、范必勤等取得试管牛犊,动物胚胎移植技术及体外受精,第60页,三、意义,体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等含有主要意义,在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效伎俩，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加紧品种改良速度等有主要价值,哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等当代生物技术不可缺乏组成个别,动物胚胎移植技术及体外受精,第61页,四、体外受精技术步骤,卵母细胞取得和体外成熟,精子体外获能,成熟卵母细胞与获能精子体外受精,受精卵体外培养,受精卵移植,动物胚胎移植技术及体外受精,第62页,体外受精,获能,次级卵母细胞减数第二次分裂中期,动物胚胎移植技术及体外受精,第63页,1,卵母细胞取得与体外成熟,1,）卵细胞采集方法,取得足够数量卵母细胞是生产试管动物前提,（,1,）从屠宰场家畜卵巢中采集,（,2,）从超数排卵卵巢取得卵泡,借助腹腔镜，手术法取卵,（,3,）阴道超声波监视穿刺法直接从牛卵巢搜集卵母细胞和内窥镜借助套筒穿刺阴道穹隆取得,动物胚胎移植技术及体外受精,第64页,2,）卵母细胞成熟,未成熟卵母细胞核在细胞中央，成熟过程中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发生泡接着进行第一次成熟分裂，,减数分裂完成标志着卵母细胞核成熟,（,1,）细胞核成熟,动物胚胎移植技术及体外受精,第65页,（,2,）细胞质成熟,显著蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，这些新合成蛋白质不但与卵细胞本身成熟相关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输精后发育能力直接相关，所以,细胞质成熟质量怎样直接影响到早期胚胎发育能力,胞质成熟主要表现为细胞器改变和纺锤体形成,卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如高尔基体消失，线粒体分布核周围，胞质内有,PAS,阳性囊膜和脂滴,动物胚胎移植技术及体外受精,第66页,（,3,）细胞膜和透明带成熟,细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退出或断裂,透明带外层呈网状，变软,动物胚胎移植技术及体外受精,第67页,2,、体外获能,指精子在体外取得受精能力过程,包含在体外环境中除去精浆和精子表面吸附大分子物质，降低表面阴性电荷，提升膜流动性，增加精子呼吸率和加紧运动幅度等一系列生理生化过程,动物胚胎移植技术及体外受精,第68页,精子体外获能是体外受精技术关键步骤，,主要包含,精子洗涤,和,添加特定成份,Brackett,（,1982,）以,高离子强度液,处理使精子获能,钙离子,在精子获能时起关键作用，能较快诱发精子超活化运动和顶体反应,氨基多糖（,GAGs,）,是牛精子获能主要物质，可促进对钙离子吸收，诱发顶体反应。如肝素也可使精子获能，但一样是一个钙离子依赖过程,血清白蛋白（,BSA,）,也可诱发精子获能。可能作为,Zn,离子融合剂引发,PLA,2,表示，或者在获能中去除精子膜上胆固醇,动物胚胎移植技术及体外受精,第69页,3,、体外受精,体外受精是以正常体内受精研究为基础，尽可能给精,卵提供一个适宜共培养体系是研究体外受精目标,受精成功标志是看受精卵是否可发育至囊胚期阶段,多精子受精一直是体外受精一个难点,动物胚胎移植技术及体外受精,第70页,4,、受精卵体外培养,受精卵要在体外条件下培养发育一段时间，再移植到受体子宫内，所以，,“,试管动物”实际上要在体外进行三个阶段培养：,第一阶段,是卵子成熟培养和精子获能培养,第二阶段,是受精培养,第三阶段,才是受精卵早期发育培养,动物胚胎移植技术及体外受精,第71页,动物胚胎移植技术及体外受精,第72页,