NY∕T 3278.2-2018 微生物农药 环境增值试验准则 第2部分：水(农业).pdf

ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3278.2一2018微生物农药环境增殖试验准则第2部分:水Environmental reproduction test guidelines for microbial pesticides-Part 2 Water 2018-07 -27发布2018-12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3278.2-2018 目IJ1=1 NY/ T 3278 (微生物农药环境增殖试验准则)，分为3个部分:一一第l部分:土壤;一一第2部分:水;一一第3部分:植物叶面。本部分为NY/T3278的第2部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:王宏伟、黄健、卡元卿、蔡小宇、袁善奎、姜辉、赵榆、杜丽娜。I 范围微生物农药环境增殖试验准则第2部分:水本部分规定了微生物农药水中的基本要求。本部分适用于为农药2 规范性引用文件下列文件对件。凡是不注日期GB 5749生3 术语和定义下列术语和3. 1 微生物农药NY/T 3278.2-2018 理、质量控制、试验报告等于本文以细菌、真菌.母4挥重唾撞撞届时苦劳苦白雪童鲸具盎-虫、草、鼠等有害生物作3.2 3.3 3.4 供试物test 试验中需要菌落形成单位由单个菌体或聚细菌芽抱bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期，眠体。3. 5 真菌抱子fungal spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性抱子和无性抱子两大类。抱子在适宜条件下发芽，形成菌丝而进行分裂繁殖;当外界环境不适宜时，可以呈休眠状态长时间生存。3.6 细菌抱囊bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下，由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。1 NY/T 3278.2-2018 3.7 原生动物抱囊protozoan cyst 某些原生动物在外界环境不利条件下，形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。3.8 细菌营养体吨etativebacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征(具细胞膜、细胞核和细胞质等)外，其细胞本身是一独立完整的有机体，通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营养和生殖等生命活动。3. 10 宿存survivaJ 具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。3. 11 增殖multiplication 微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。3. 12 延滞期lag ph描e少量微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，微生物数目没有增加的一段时期。3. 13 指数期log phase 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期。3. 14 稳定期stationary ph描e新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期，这个时期的菌体数量达到最高。3. 15 衰亡期death phase 微生物的个体死亡速度超过新增殖速度，整个群体呈现负生长状态的时期。4 试验概述将供试物接种到无菌人工水中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其数量，得到供试物在水中的动态变化。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验用水推荐以人工配制水为试验用水。1L自来水中加人10.8mg葡萄糖和0.45mg(NH4 )2S04调节人工水pH为7.57:tO. 30。人工水121.C高压蒸汽灭菌25min30 min。试验用自来水符合GB5749的规定。5. 1. 2 供试物5. 1. 2. 1 类型供试物包括微生物农药母药、制剂产品。5. 1.2.2 批次试验中供试物应采用同一批次的产品。5. 1.3 主要仪器设备超净工作台。磁力搅拌器。灭菌锅。显微镜。分光光度计。荧光定量PCR 仪。温度计。天平。5. 2 试验操作5.2. 1. 1 处理组设置供试物5.2.2 接种量接种浓度为菌株接种浓度。200 mL试验用水5. 2. 3 接种与培养在超净工作台内均匀，置于振荡培养箱参数。5. 2. 4 取样与存放NY/T 3278.2-2018 自接菌后第1d开始取样，目、配神通南疆o刻十数测试。4d后每隔ld取一次样品。取样量和取样间隔冒-腿据受试物的生长情况、国-阻40C保存。5.2.5 计数方法5.2.5. 1 细菌、放线菌、真菌、酵母以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法(参见附录A)、绿色荧光蛋白基因标记平板计数法(参见附录B)测定。以基因拷贝数为计数单位，可采用分子标记一荧光定量PCR法(参见附录C)测定。5. 2. 5. 2 原生动物、真菌抱子、酵母以个体数目为计数单位，可采用直接计数法(参见附录D)等测定。5. 2. 6 试验周期试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期;或在28d内持续检测确认供试物含量维持稳定或显著低于接种量，则可结束试验。3 NY/T 3278.2-2018 5. 2. 7 生长-消亡曲线以培养时间为横坐标、以供试物菌落数含量的对数为纵坐标做图，绘出供试物的生长-消亡曲线。5. 3 数据处理5. 3. 1 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。式中:Xj，X2一一分别为两样本平均数;lX2一分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3.2 单因子方差分析(One-Way ANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式(z)计算。(1) LSDa = ta(df，)S王亏 式中:ta(dJ，)一一在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;S一写一一均数差异标准误，按式(3)计算。式中:MS.一-F检验中误差均方;m 一一各处理重复数。S一可= JzMS./页. . . . . (3) 5. 4 质量控制第Od时灭菌水中不得检出微生物活菌。使用荧光定量PCR法计数微生物数量时，扩增效率的范围应为90%llO%。6 试验报告试验报告应包括下列内容，但不限于以下内容:a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;d) 供试物基本信息(如含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、施用量、施用方法等); e) 试验系统的详细描述;f) 试验条件，包括试验温度、pH、营养盐、转速、光照等;g) 试验结果，绘制供试物的生长-消亡曲线。4 A. 1 方法原理根据微生物特征选择合适将水样经无菌水或适当成一个菌落，根据形成的菌A.2 试剂A. 2. 1 蛋白陈。A. 2. 2 牛肉膏。A. 2. 3可A. 2. 4 酵母膏。A. 2. 5 麦芽汁。A. 2. 6 葡萄糖。A. 2. 7 硝酸挥。A. 2.8 氯化铀。A. 2. 9 磷酸二氢A. 2.10 磷酸氢-A. 2. 11七A. 2.12 A.2.13 吐温80。A. 2.14 孟加拉红。A. 2.15 氯霉素。A.2.16 氢氧化铀溶液:1mol/ A. 2.17 盐酸溶液:1mol/L。A. 2.18 琼脂。注:以上化学试剂均为分析纯。A.3 仪器设备A. 3. 1 高压蒸汽灭菌锅。A. 3. 2 恒温培养箱。A. 3. 3 超净工作台。A. 3. 4 酸度计等。NY/T 3278.2-2018 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法物计数。个细胞生长并繁殖5 NY/T 3278.2-2018 A.4 固体培养基平板的制备1)A. 4. 1 细菌培养基平板用于细菌的培养。称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化铀5g、琼脂粉15g18 g，于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化饷溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL, 121.C高压灭菌20min30 mino培养基温度降至约50.C后倒入直径为9cm的元菌培养皿中，每板约15mL。A. 4. 2 高氏1号培养基用于放线菌的培养。称取可溶性淀粉20g、硝酸饵1g、氯化铀0.5g、磷酸氢二押0.5 g、七水硫酸镜0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂粉15g，于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化铀溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL = 角瓶中，每瓶200mL, 121.C高压灭菌20min30 min。培养基温度降至约50.C后倒入直径为9cm的无菌培养皿中，每板约15mL。A. 4. 3 孟加拉红培养基用于酵母菌和真菌的培养。称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢饵1g、硫酸镜0.5g、琼脂粉15 g18 g、孟加拉红0.03g于900mL蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL。分装于500 mL三角瓶中，每瓶200mL, 121.C高压灭菌20min 30 min。培养基温度降至约50.C后，按照1000 mL中含有氯霉素0.1g的比例加入氯霉素，轻摇混匀，倒人直径为9cm的无菌培养皿中，每板约15 mL。A. 4. 4 酵母培养基用于酵母菌的培养。称取酵母膏3g、麦芽汁3g、蛋白豚5g、葡萄糖10g、琼脂粉20 g，于900mL 蒸馆水中，煮沸搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL。分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL, 121.C 高压灭菌20min30 mino培养基温度降至约50.C后倒人直径为9cm的元菌培养皿中，每板约15mL。A.5 水样的处理吸取1.0 mL水样，加入盛有9mL无菌水或适当分散液(女日0.05%吐温80溶液)的三角瓶中，定容至10mL，振荡10min混合均匀，即成10-1水溶液。A.6 样品的稀释涂布用元菌刻度吸管吸取1mL上述10-1水溶液到9mL无菌水中，充分振荡，即成10-2溶液。按此方法逐步稀释，细菌通常稀释到10-8，并选择10-81O-6稀释菌悬液用于平板涂布;真菌通常稀释到1。一7，并选择10-710-5稀释菌悬液用于平板涂布。吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用元菌玻璃涂棒或接种针均匀涂抹于培养基表面，将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。当用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度(即低浓度菌悬液)开始，依次吸取较低稀释度的菌悬液顺序操作。A.7 菌落计数6 细菌培养基平板培养1d3 d后取出，选择细菌菌落数量20200之间的培养皿进行计数。放线菌培养基平板培养5d7 d后取出，选择菌落数量20200之间的培养皿进行计数。酵母、真菌培养基平板培养3d5 d后取出，选择真菌菌落数量10100之间的培养皿进行计数。1) A. 4. 1A. 4. 4培养基配方仅供参考，可根据供试物生物学特征选择最适合的培养基配方。NY/T 3278.2-2018 菌落计数按式(A.1)计算。. (A. 1) 式中:C一-每毫升水样中菌落数含量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL);CA-平板菌落平均数，单位为菌落形成单位(CFU); F -一一稀释倍数;V一一一水样量，单位为毫升(mL)。-F-v -FU -h-vlljtiltlili-t101 7 NY/T 3278.2-2018 附录B(资料性附录)绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法备设器。1234仪唱，nJ句IvanF同JV户hunxunHJV唱BB唱EE唱EE噜EE唱a呵/内/nJ内，nJnJnJnJnJnJnJnJnJnJn/叫JVRURURURURHRHRURHRURURHRURURDRHRM a B.1 方法原理B. 3. 1 超净工作台。B. 3. 2 摇床。B. 3. 3 恒温水浴锅。B. 3. 4 低温高速离心机。B. 3. 5 恒温培养箱等。B.4 绿色荧光蛋白基因标记菌株的制备B. 4. 1 细菌B. 4. 1. 1 细菌感受态细胞制备取供试细菌划线接种在LB固体培养基(膜蛋白陈10g、酵母提取物5g、NaCl10 g、琼脂粉15 g18 g，蒸馆水1000mL, 121 oc高压灭菌20min)平板上，370C培养过夜。从长好的平板上挑取一个NY/T 3278.2-2018 单菌落，转接在含有3mLLB液体培养基的试管中，37C振荡培养过夜。取0.3mL菌液接种于20mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，3 7C振荡培养2h3 h，待OD600值达到O.30. 4时，取下三角瓶，立即置冰浴10min 15 min。将细菌转移到一个灭菌的50mL离心管中，40C、3000r/min离心10min, 弃去上清液，收集菌体。加人20mL用冰预冷的O.1 mol/ L CaClz溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30mino 40C、3000r/ min离心10min，弃去上清液。再加入2mL用冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液，小心重新悬浮菌体。在40C冰箱中放置12h24 h，即可应用于转化。B. 4. l. 2 细菌的转化取供试细菌新鲜感受态细胞100L于1.5 mL离心管中，加人50ng100 ng含绿色荧光蛋白基因及氯霉素抗性的质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30mino 420C热休克120s，不要摇动离心管。加人LB液体培养基900L，37C保温60min。取100L转化液涂布在含氯霉素的LB固体平板上，3 7C倒置培养16h24 h。观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。含有抗性基因的菌株作为供试物用于水增殖测试。B.4.2 真菌B. 4. 2.1 真菌原生质体制备分别称取溶壁酶(2%)、蜗牛酶(4%)共溶于5mL O. 8 mol/ L MgS04溶液(pH5.0)中，经O.22m 灭菌微孔滤膜过滤除菌，制备成复合酶液。将获得的真菌抱子配置成1X 107个/mL抱子悬浮液。在250 mL三角瓶中装入100mL马铃薯煎糖液体培养基(马铃薯200g、康糖20g、蒸馆水100mL, 121 oC 高压灭菌20min) ，加人上述抱子悬液1mL，在250C280C、180r/ min摇床培养12h后收集菌丝。然后称1g湿菌丝，加入4mL复合酶液，于300C下缓慢振荡温浴2h3 h，经放置有4层无菌纱布的漏斗过滤，离心收集原生质体，40C保存以备转化。B.4.2.2 原生质体转化转化采用PEG/CaClz融合法。取上述已纯化的原生质体100L(浓度为108个/mL)，加入5L含绿色荧光蛋白基因及潮霉素抗性的质粒(含10LDNA) ，混匀后冰浴20min30 min;然后加人1. 25 mL PEG溶液，室温静置10min;加人1mL STC溶液稀释，40C、3000r/ min离心30min;弃上清液，将沉淀的原生质体悬浮于400L高渗再生液体培养基(蛋白陈19、葡萄糖19、酵母粉0.5g、牛肉膏0.5 g、NaCl0.5 g、煎糖17.1g、MgClz0.19 g、蒸馆水100mL，灭菌20min)中。300C摇床培养12 h16 h后，涂布于含潮霉素的培养基平板上，30oC静置培养5d7 d，筛选含有抗性基因的菌株(即转化子)。含有扩L性基因的菌株作为供试物用于水增殖测试。B.5 样晶稀释涂布用元菌刻度吸管吸取1mL水样到9mL无菌水中，按10倍法依次稀释，通常稀释到10-60根据水样中微生物的数量选择合造倍数的悬液接种，细菌一般采用10-610-4稀释液用于平板涂布;真菌一般1O-31O-1稀释液用于平板涂布。吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用无菌涂布棒均匀涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度开始，然后依次吸取较低稀释度的悬液。将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。B.6 菌落计数细菌在培养基平板培养1d3 d后取出，在紫外透射仪波长230nm下计数荧光菌落，选择荧光菌落数量20200之间的培养皿进行计数。真菌在培养基平板培养3d5 d后取出，在紫外透射仪波长230nm下计数荧光菌落，选择荧光菌落数量10100之间的培养皿进行计数。菌落计数与式(A.1)同。单位水样菌落计数按式(A.1)计算。9 NY/T 3278.2-2018 C.1 方法原理本方法可用于细菌、在普通聚合酶链一个报告荧光基团和扩增时，Taq酶的5接受到荧光信号，形成完全同步。C.2 C. 2. 1 C. 2. 2 C. 2. 3 C. 2. 4 C. 2. 5 C. 2. 6 C.3 C. 3. 1 C. 3. 2 C. 3. 3 C. 3. 4 C.4 水体微生物基因组DNA-200C下保藏。C.5 荧光PCR检测附录C(资料性附录)分子标记-荧光定量PCR法酸，两段分别标记灭基团吸收，PCR而荧光监测系统可与PCR产物获得的水体基因组DNA在荧光PCR扩增反应体系如下:10 X buffer 2. 5L;dNTPClO mmol/L) 2L;菌种特异性正反引物各lL;rTaq酶O.5L;双蒸水15L;荧光定量探针(2mol/L)1L;基因组模板2L，共计25LoPCR 扩增反应程序如下:950C预变性3min; 950C 10 s变性，600C30 s退火延伸，600C时收集FAM荧光;共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。反应完毕后，荧光定量PCR仪检测系统根据阔值自动生成的动力曲线及Ct值。C.6 标准曲线的建立将梯度稀释的含有目的片段的(101拷贝/L108拷贝/L)的DNA作为模板，进行荧光定量NY/T 3278.2-2018 PCR，以模板拷贝数的对数值为X轴、Ct值为Y轴做图，建立检测标准曲线。扩增效率计算CE):E的范围应为90%110%，保证qPCR每完成一个循环，底物浓度扩增1倍;按式cc.1)计算。E = (10-1/ k -1) X 100Cc. 1) 式中:E 扩增效率，单位为百分率C%); h一一标准曲线斜率。C.7 样晶中基因拷贝数计算根据样品反应结束后生成的Ct值和已建立的标准曲线，计算各样品中目的基因片段的拷贝数。11 NY/T 3278.2-2018 附录D(资料性附录)亘接计数法式中:C 一一每毫升水样中CA-lmL稀释液中F 水样稀释倍数;V 一一水样量，单位为毫升(mL)。D D. 1 方法原理本方法可用于原生动将水样与无D.2 D.2. 1 D. 2. 2 D. 2. 3 D. 2. 4 D. 2. 5 D.3 D.4 D.5 12 NY/T 3278.2-2018 参考文献lCanada PMRA, 1998. Guidelines for the Registration of Microbial Pest Control Agents and Products. 2GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定.3Japan MAFF, 1997. Guidelines for Safety Evaluation of Microbial Pesticides. 4Primrose S,Twyman R,Old B，2002.基因操作原理M.第六版.瞿礼嘉，顾红雅，译.北京:高等教育出版社.5SN/ T 2101-2016 出口乳及乳制品中结核分校杆菌检测方法-荧光定量PCR法.6USEPA, 1996. Microbial Pesticides Test Guidelines OPPTS 885.4050. 13 gON|N.hSH问Z中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境增殖试验准则第2部分:7.1NY/ T 3278.2- 2018 * 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:.ccap. corn. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争导等* 印张1.25 字数25千字2018年11月北京第1次印刷争e开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年11月第1版书号16109 4635 定价30.00元* 版权专有侵权必究举报电话[phone]