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离体保存技术方法
种质是亲代经过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。
种质资源保存是指在天然或人工创造的适宜环境条件下, 贮存植物种质, 使其保持生命力与遗传性的技术。
种质保存的方式有原地保存和异地保存。原地保存主要经过建立自然保护区、 天然公园来实现种质保存的目的; 异地保存则经过建立植物园、 种质资源圃、 种子库以及离体保存等方法来实现。
离体保存是将单细胞、 原生质体、 愈伤组织、 悬浮细胞、 体细胞胚、 试管苗等植物组织培养物储存在使其抑制生长或无生长条件下, 达到保存目的的方法。
离体种质保存有以下优点:
①占空间少, 节省大量的人力、 物力和土地;
②便于种质资源的交流利用;
③需要时, 能够用离体培养方法很快大量繁殖;
④避免自然灾害引起的种质丢失。
离体种质保存的不足之处:
①对于限制或延缓生长的处理, 需定期转移, 连续继代培养;
②易受微生物污染或发生人为差错;
③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失。
离体种质保存主要有低温保存和超低温保存两种方式
第一节 低温保存
低温保存是在低于正常培养温度下保存植物组织培养物的技术, 该方法常结合改变培养基成分、 控制光照等措施, 以减缓保存材料的生长速度, 延长继代时间, 故又称小生长法。该法简单易行, 需要设备少, 投资小, 技术成熟, 能够作为植物种质资源的中长期保存方法。
低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养, 不断繁殖更新。保存过程中要选用遗传上稳定的外植体作为起始培养材料, 以尽可能地减少遗传变异的机会。因此具有器官分化能力的体细胞胚和植物茎尖分生组织, 能够保持发育的完整性, 在遗传上也较稳定, 适于用做低温保存的起始材料。
低温保存的基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。在一定温度范围内材料的寿命随保存温度的降低而延长, 一般5～10℃适宜保存温带起源植物的试管苗, 15～18℃可用于热带植物试管苗的保存。适当缩短光照时间, 降低光照强度, 也能减缓材料的生长速度, 延长保存时间。但也要防止光照过弱使材料生长纤细, 形成弱苗。导致生长不维持。
改变培养基成分:
生长抑制剂保存: 在其中添加脱落酸( ABA, 最大用量一般为5-10mg/L) 、 矮壮素( CCC) 、 青鲜素、 多效唑( PP333) 等生长延缓剂;
高渗保存: 添加甘露醇、 蔗糖( 其质量分数由3%提高到10%, 可明显抑制培养物的生长) 、 PEG等渗透剂。其中以对材料遗传稳定性影响小的甘露醇为最好, 培养基中加入较低含量的甘露醇能够明显提高材料的存活率。
饥饿保存: 从培养基中减去1~2种营养元素, 使植株缺乏相关营养而处于最小生长量。

低温保存技术( 以魔芋为例) :
1、 选取茎尖分生组织为外植体, 建立试管苗无性系
2、 选取生长健壮的、 芽大小为1.5cm的材料移入保存培养基, 于25℃, 光照度1000lx, 12h条件下培养一周( 培养基中添加脱落酸和甘露醇)
3、 转入4℃黑暗中保存。
4、 材料每6个月继代培养一次, 继代培养时, 从形态、 经济性状、 生理生化等方面进行遗传稳定性鉴定。

第二节 超低温保存

超低温保存也叫冷冻保存, 一般以液态氮( -196℃) 为冷源, 使温度维持在-196℃。在如此低温下, 新陈代谢活动基本停止, 处于”生机停顿”( suspended animation) 状态。在此状态下材料不可能产生遗传变异。可对材料进行长期保存。
超低温保存1949年成功的应用于动物细胞的保存。20世纪70年代以来, 应用于植物材料保存, 当前已经有不少成功的例子。在超低温保存中茎尖和幼胚等较为合适。这些材料遗传稳定, 再生能力强, 解冻后易于成活和种植, 对于冷冻和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力也强。
保存原理: 低温冰冻过程中, 如果生物细胞内水分结冰, 细胞结构就遭到不可逆的破坏, 导致细胞核组织死亡。植物材料在超低温条件下, 冰冻过程中避免了细胞内水分结冰, 而且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。植物细胞含水量大, 冰冻保存难度大, 投放液氮中易引起组织和细胞死亡, 故须借助于冷冻保护剂, 防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏, 保护细胞。
超低温保存的基本程序包括预处理、 冷冻处理、 冷冻贮存、 解冻和再培养。
一、 冷冻的方法
( 一) 快速冷冻法
本法是将植物从0℃或其它预处理温度直接投入液氮。其降温速度在每分钟1000℃以上。在降温冷冻过程中, 从-10℃到-140℃是植物体内冰晶形成和增长的危险温度区, 在此以下冰晶不再增生。因此, 快速冷冻成功的关键在于利用超速冷冻, 使细胞内的水迅速越过冰晶生长的危险温度区。细胞内的水形成”玻璃化”状态。采用快速冷冻方法, 要求细胞体积小, 细胞质浓厚, 含水量低, 液泡化程度低的材料。如: 高度脱水的种子、 花粉、 球茎或块根, 茎尖分生组织等。
( 二) 慢速冷冻法
本法是以每分钟0.1～10℃的降温速度( 一般1～2℃/min) 使材料从0℃降至-100℃左右, 稳定1h, 随即浸入液氮, 或者以此降温速度连续降温至-196℃。在此条件下能够使细胞内的水有充分的时间不断地转移到细胞外结冰, 从而使细胞内的水分减少到最低限度, 避免在细胞内结冰。本法适用于成熟的、 含有大液泡和含水量高的细胞, 对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。
( 三) 分步冷冻法
此法是指植物的组织和细胞在放入液氮前, 经过一个短时间的低温锻炼。可分为两步冷冻法和逐级冷冻法两种。可使保存材料细胞内充分脱水, 避免因细胞内结冰而导致不可逆伤害的出现。
1．两步冷冻法
此法实际是慢速冷冻法和快速冷冻法的结合。它的第一步是采用0.5-4℃/min的慢速降温使温度从0℃降至-40℃; 第二步是投入液氮迅速冷冻。植物材料在第一步冷冻后, 必须停留一段时间, 使材料充分脱水。材料悬浮培养细胞和愈伤组织的冷冻保存多使用此法。
2．逐级冷冻法
此法是在程序降温仪或连续降温冷冻设备的条件下采用的一种冷冻保存方法, 一般先制备不同等级温度的溶液。如-10℃、 -15℃、 -23℃、 -35℃、 -40℃等。植物材料经冷冻保护剂在0℃处理后, 逐级经过这些温度。在每一级别温度中停留一定时间( 4-6min) 然后浸入液氮。这种方法使细胞在解冻后呈现较高的活力。
( 四) 干燥冷冻法
此法是将植物材料置于27～29℃烘箱内, 使其含水量由72-77%降至27-40%后, 再浸入液氮, 能够使植物材料免遭冻死。用真空干燥法使细胞脱水则效果更好。
二、 提高冷冻后细胞或组织存活率的方法
( 一) 植物材料的性质
冷冻前材料的性质, 包括物种、 基因型、 抗寒性、 年龄、 形态结构和生理状态等, 都会对冷冻效果产生很大影响。一般来说, 小而细胞质浓厚的分生组织或细胞, 比大而高度液泡化的细胞容易存活。因此应当选用频繁继代的愈伤组织材料。胚状体也以幼龄的球形胚存活率最高, 心形胚次之, 子叶胚最低。而较大的组织材料则仅有分生细胞可能重新生长。
( 二) 冷冻前的预处理
1．悬浮培养或继代培养
在悬浮培养中, 可采用饥饿法使细胞分裂处于同步。增加指数生长期的细胞, 能有效提高保存存活率。方法为: 先使细胞在不含磷酸盐的培养基中饥饿4天。再转入正常培养基中进行同步化。另外在培养基中加入细胞分裂抑制剂如5-氨基尿嘧啶、 羟基脲和胸腺嘧啶核苷等。使细胞滞留在G1期和S期的边界上, 去除抑制剂后, 细胞即达成同步化。
2．预培养
冷冻前对材料进行短暂培养能够提高冷冻处理后的存活率。一般加入5%二甲基亚砜( DMSO) 预培养48h。将细胞适度脱水, 也可提高存活率。
3．低温锻炼
将植物茎尖在冷冻之前, 放在4℃下处理3天。可提高存活率。
4．冷冻防护剂
冷冻防护剂能够防止细胞的溶液效应的毒害。它具备以下作用:
a) 降低冰点, 促进过冷却和玻璃态化的形成;
b) 提高溶液的黏滞性, 阻止冰晶形成;
c) 增加细胞膜的透性。DMSO能够使膜物质分子重新分布, 增加细胞膜的透性, 在温度降低时, 加速细胞内的水流往细胞外结冰;
d) 稳定细胞内的大分子正常结构, 特别是膜结构, 阻止低温对膜的伤害。
冷冻保护剂应具有分子质量较小、 易于与溶剂混合、 快速渗入细胞、 无毒或毒性小、 易洗脱等特性。常见的是DMSO。甘油、 糖、 糖醇类也是冷冻防护剂。DMSO应当在30～60min的一段时间内逐渐加入以免对细胞产生毒害作用。脯氨酸是植物体内天然的防护剂。
( 三) 解冻方法
1．快速解冻法
把冷冻材料直接投入37～40℃的温水中。解冻速度为500～700℃/min。化冻后转入冰槽中保存。材料解冻时的再次结冰危险区域是-50至-10℃。该法可能尽快度过这一区域。大多数植物材料可采用此种方法。
2．慢速解冻法
把冷冻材料先置于0℃下, 然后逐渐升至室温, 让其慢慢解冻。适用于细胞含水量较低的物种或材料。如木本植物的冬芽等。
植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。解冻方法的选择不但与材料特性有关, 还与冷冻时采用的方法有关。快速冷冻的材料也应快速解冻。同时还要注意材料的避免机械损伤; 一旦解冻, 就应把试管转至20℃水浴中, 并尽快洗涤材料和再培养, 以免热伤害。
( 四) 重新培养
将解冻的材料, 重新置于培养基上使其恢复生长。如加了防护剂, 则应当先将材料洗涤几次。以去除防护剂的毒害作用。但此过程中也将一些冷冻过程中细胞渗漏出来的对于培养有利的物质去除掉了, 因此有时不去除防护剂也可。
另外, 在再培养早期, 一般有一个生长停滞期。它的长短取决于细胞的损伤程度、 保护剂的浓度, 也与植物材料和基因型有关。

超低温冷冻保存技术( 以玉米为例) :
1、 新建玉米悬浮培养体系
2、 新鲜培养基洗涤悬浮细胞
3、 加入等量的冷冻保护剂脯氨酸
4、 冰上保存1h
5、 冷冻保存, 先降温至-30℃( 1℃/min) , 停留半小时, 再投入液氮
6、 以40℃水浴解冻( 1-2min) , 然后培养。

三、 冷冻保存后细胞和器官活力的检测
最基本的活力检测方法是再培养法。还有染色法: FDA、 伊凡蓝法、 TTC等。根据组织细胞的复活程度、 存活率、 生长速度、 组织块的大小和重量的变化, 以及分化产生植株的能力和各种遗传性状来表示。
存活率 = 重新生长细胞( 或器官) 数目/解冻的细胞( 或器官) 的数目×100%
在冷冻和化冻期间受过不同程度损伤的细胞或器官也可能再生出完整的植株。这是由于培养材料再生出了次级的分生组织的原故。
四、 冷冻保存的应用前景
种质保存的根本目的是保持遗传基因的稳定及其所控制的遗传性状不发生改变。其用途有:
1、 长期保持种质的遗传稳定性。
2、 长期保存去病毒的种质。
3、 保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。
4、 保持不稳定性的培养物, 如单倍体。
5、 保持培养细胞形态发生的能力。
6、 防止种质衰老。
7、 延长花粉的寿命, 解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。
8、 冷冻解冻过程可能起着离休筛选作用, 将那些生命力强、 抗逆性强的细胞系选择下来, 再生植株可能成为抗逆( 抗寒) 的新品种。
9、 便于国际间的种质交换。

图1 植物离体材料超低温保存的基本程序