细菌的生物化学试验.doc

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细菌的生物化学试验

编写人
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日期
2009-10-20
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2009-10-20
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2009-10-20
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各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
1.碳水化合物的代谢试验
1.1糖（醇、苷）类发酵试验
1.1.1原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
1.1.2方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
 1.1.3 结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。
 1.1.4 应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵 不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
    表 1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类
单糖 四碳糖：赤藓糖 ; 五碳糖：核糖、 核酮糖、 木糖、
阿拉伯糖; 六碳糖：葡萄糖、 果糖 、半乳糖 、甘露糖
双糖     蔗糖（葡萄糖＋果糖）、   乳糖（葡萄糖＋半乳糖）、
    麦芽糖（两分子葡萄糖）
三糖     棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）
多糖     菊糖（多分子果糖）、 淀粉
醇类     侧金盏花醇、 卫茅醇、 甘露醇 、山梨醇
非糖类   肌醇
1.2．葡萄糖代谢类型鉴别试验
1.2.1 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
1.2.2 方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。
1.2.3 结果： 两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
1.2.4 应用：主要用于肠杆菌科和其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。
1.3．甲基红（MR）试验
1.3.1 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。
1. 3.2 方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。
1.3.3 结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。
1.3.4 应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志 贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
1.4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
1.4.1 原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属和沙门菌属的鉴别。
1. 4.2 方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。
1.4.3 结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。
1.4.4 应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
1.5．VP试验
1.5.1 原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而和培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合 形成红色化合物。即V-P试验阳性。
1.5.2 方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。
1.5.3 结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。
1.5.4 应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常和MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。
1.6．胆汁七叶苷水解试验
1.6.1原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素和培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
1.6.2 方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观察结果。
1.6.3 结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
1.6.4 应用：主要用于鉴别D群链球菌和其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。D群链球菌本试验为阳性。
1.7．淀粉水解试验
1.7.1 原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围出现透明区。
1.7.2 方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃孵育18~24h，加入革兰碘液数滴，立即观察结果。
1.7.3 结果：阳性反应，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反应，培养基全部为蓝色。
1.7.4 应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。
1.8．甘油复红试验
8.1原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛和无色的复红生成醌式化合物，呈深紫红色。
1.8.2方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培养基中，于35℃孵育，观察2~8d。应同时做阴性对照。
1.8.3结果：紫红色为阳性，和对照管颜色相同为阴性。
1.8.4应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。
1.9．葡萄糖酸氧化试验
1.9.1原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可和班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
1.9.2方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，观察结果。
1.9.3结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。
1.9.4应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。
2.氨基酸和蛋白质的代谢试验
2.1硫化氢试验
2.1.1原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，和亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀物。
2.1.2方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培养基或克氏双糖铁琼脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，观察有无黑色沉淀出现。或用醋酸铅纸条，悬挂于KIA管中（白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的50g/L醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高压灭菌备用）。醋酸铅是最敏感的方法。
2.1.3结果：有黑色沉淀物为阳性。
1.4应用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。
2.2．明胶液化试验
2.2.1原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。
2.2方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育24h到7d或更长时间，每24h取出放入4℃冰箱约2h后，观察有无凝固。
2.2.3结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。如凝固，则继续培养。
2.2.4应用：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。
2.3．吲哚试验（靛基质试验）
2.3.1原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚和对二甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚。
2.3.2方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，加入靛基质试剂，观察结果。
2.3.3结果：红色为阳性，无色为阴性。
2.3.4应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。
2.4．苯丙氨酸脱氨酶试验
2.4.1原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。
2.4.2方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。
2.4.3结果：有绿色出现为阳性。
2.4.4应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。
2.5．氨基酸脱羧酶试验
2.5.1原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。
2.5.2方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶试验管和1支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，观察结果。
2.5.3结果：若为溴甲酚紫指示剂，则试验管紫色为阳性，黄色为阴性，对照管应为黄色。
2.5.4应用：主要用于某些细菌种间的鉴别，如赖氨酸用于产气肠杆菌（阳性）和阴沟肠杆菌（阴性）；鸟氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和克雷伯菌（阴性）；精氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）等。
2.6．精氨酸双水解酶试验
2.6.1原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。
2.6.2方法：将待检菌接种于试验培养上，置35℃孵箱孵育1~4d，观察结果。
2.6.3结果：溴甲酚紫指示剂呈紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性。黄色为阴性。
2.6.4应用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属的鉴定。
2.7．尿素酶试验
2.7.1原理：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱。
2.7.2方法：将待检菌接种于含有尿素的培养基中，35℃孵育18~24h，观察结果。
2.7.3结果：红色为阳性，不变为阴性。
2.7.4应用：主要用于肠杆菌科变形杆菌属、普罗威登菌属、克雷伯菌属及假单胞菌属的鉴定。
2.8．霍乱红试验
2.8.1原理：霍乱弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，当加入硫酸后生成亚硝酸吲哚，呈红色反应。
2.8.2方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入浓硫酸数滴，观察结果。
2.8.3结果：呈红色者为阳性。
2.8.4应用：霍乱弧菌呈阳性反应，但本试验并非霍乱弧菌所特有。凡能产生吲哚并还原硝酸盐为亚硝酸盐的细菌，均可呈现阳性反应。
3.碳源和氮源利用试验
3.1枸橼酸盐利用试验
3.1.1原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。。
3.1.2方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。
3.1.3结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。
3.1.4应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。
 3.2．丙二酸盐利用试验
3.2.1原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培养基变碱。
3.2.2方法：将待检菌接种于丙二酸盐培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。
3.2.3结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。
3.2.4应用：肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其它各菌属均为阴性。
3.3．醋酸钠利用试验
3.3.1原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源，同时，利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培养上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培养基变为碱性。
3.3.2方法：将被检菌接种于醋酸盐培养基中，置35℃孵育2~7d，逐日观察结果。
3.3.3结果：培养基上有细菌生长，并变为蓝色为阳性。
应用：主要用于大肠埃希菌和志贺菌属的鉴别，前者为阳性，而后者为阴性。
3.4．马尿酸钠水解试验
3.4.1原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。
3.4.2方法：将待检菌接种于马尿酸钠培养基中，置35℃孵育48h，离心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀，经10~15min观察结果。
3.4.3结果：出现恒定之沉淀物为阳性。
应用：主要用于B群链球菌的鉴定。
3.5、乙酰胺利用试验
3.5.1原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱。
3.5.2方法：将被检菌接种于乙酰胺培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。
3.5.3结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培养基颜色不变为阴性。
3.5.4应用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性，其它非发酵菌大多数为阴性。
4.酶类试验
4.1.氧化酶试验
4.1.1原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接和氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果和细胞色素C的存在有关。
4.1.2方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。
4.1.3结果：阳性者立即变粉红色，5~10s内呈深紫色。无色为阴性。
4.1.4应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属和肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。
注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
4.2．触酶试验
4.2.1原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
4.2.2方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％H2O2 1滴，立即观察结果。
4.2.3结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。
4.2.4应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。
  注意事项：①3％H2O2溶液要新鲜配制。②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应，③取对数生长期的细菌。
4.3．凝固酶试验
4.3.1原理：凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是和细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。
4.3.2方法: ①玻片法：在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物和其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10~20s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环，和菌悬液混合，观察结果。②试管法：于试管内加1：4稀释的兔或人血浆0.5ml，再加1~2个待试菌菌落，置37℃水浴，每30min观察1次结果。
4.3.3结果：①玻片法：5~10s内出现凝集者为阳性。②试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
4.3.4应用：本试验仅用于致病性葡萄球的鉴定。
注意事项：①玻片法为筛选试验，阳性、阴性均需进行试管法测定。②血浆必须新鲜。③应使用肝素而非枸橼酸盐作抗凝剂抗凝的血浆。④本试验也可用市购的胶乳凝集试验试剂盒测定。
4.4．DNA酶试验
4.4.1原理： 某些细菌能产生DNA酶，水解外源性DNA使之成为寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸则不会。故在DNA琼脂平板上加盐酸后，可在菌落周围形成透明区。
4.4.2方法：在DNA琼脂平板上点种待检菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L盐酸倾注平板，观察结果。
4.4.3结果：如菌落周围有透明区者为阳性，无透明区为阴性。
4.4.4应用：主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。沙雷菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌DNA酶均阳性。
4.5．胆汁溶菌试验
4.5.1原理：胆汁或去氧胆酸钠能导致某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降低了细菌细胞膜上的表面张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂解。另一方面可能和激活细菌体内的自溶酶有关。
4.5.2方法：①试管法：用纯培养物制备1ml生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.5ml。其中一管加0.5ml 100g/L去氧胆酸钠为试验管，另一管加0.5ml生理盐水作对照。35℃孵育每小时观察1次结果。②平板法：在血平板上选取单个可疑菌落，作好标记，直接在菌落上加1接种环20g/L去氧胆酸钠（pH7.0），置35℃孵育30min（平板不要翻转）观察结果。
4.5.3结果：①试管法：在3h内液体透明为阳性。②平板法：如菌落消失，仅留下溶血区为阳性，菌落不消失为阴性。
 4.5.4应用：用于肺炎链球菌的鉴定。
4.6．硝酸盐还原试验
4.6.1原理：硝酸盐还原反应包括两个过程，其一是在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；另一是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如沙雷菌属；有的细菌还可以将其还原产物在合成性代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物如氮或氧化氮，则称为脱硝化或脱氮化作用。某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐和醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸和试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者和α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸。
4.6.2方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基（内含小倒管）中，35℃孵育1~4d。将甲、乙等量混合液（用时混合）0.1ml加于试管内，立即或10min内观察结果。
4.6.3结果：出现红色为阳性反应。如欲观察有无氮气产生，可于培养基管内加1只小倒管，有气泡产生，则表示有氮气生成。如欲检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色表明硝酸盐仍存在；若不出现红色，表示硝酸盐已被分解。
4.6.4应用：本试验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；假单胞菌属中有的细菌能产生氮气，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、斯氏假单胞菌，有的则能还原硝酸盐为亚硝酸盐，如鼻疽假单胞菌等；厌氧菌如韦荣菌也能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
4.7卵磷脂酶试验
4.7.1原理：细菌产生的卵磷脂酶，经钙离子作用，能迅速分解卵黄或血清中的卵磷脂形成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。
4.7.2方法：取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35℃孵育3~6h，观察结果。
4.7.3结果：3h后在菌落周围形成乳白色混浊，即为卵磷脂酶试验阳性，6h后该混浊圈可扩大到直径5~6mm。
4.7.4 应用：该试验主要用于厌氧的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。蜡样芽孢杆菌亦为阳性。
4.8磷酸酶试验
4.8.1原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使单磷脂水解，其反应可根据反应基质不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放酚酞，在碱性环境中呈红色。
 4.8.2方法：取待检菌接种于磷酸酚酞琼脂平板上，置35℃孵育18~24h，于平皿盖内加1滴浓氨水，熏蒸片刻，观察结果。亦可用液体培养基，经孵育后，向管内加400g/L氢氧化钠溶液1滴，观察结果。
 4.8.3结果：菌落变为红色者为阳性。
 4.8.4应用：主要用于致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌的鉴别，前者为阳性，后者为阴性。
4.9脂酶试验
4.9.1原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。在培养基中加入维多利亚蓝可和脂肪结合成为无色化合物，如果脂肪被分解，则维多利亚蓝释出，呈蓝色。
4.9.2方法：将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培养基中，置35℃孵育24h，观察结果。
4.9.3结果：培养基变为深蓝色者为阳性，否则可呈无色或粉红色。
9.4应用：主要用于厌氧菌鉴定。在拟杆菌中产黑色素拟杆菌中间亚种产生脂酶，其它拟杆菌阴性；在梭菌属中诺维梭菌和产芽胞梭菌也产生此酶，其它梭菌为阴性。
4.10．CAMP试验
4.10.1原理：B群链球菌（无乳链球菌）产生一种“CAMP”因子，此种物质能促进葡萄球菌的β-溶血素的活性。因此，可在两种细菌的交界处溶血力增强，出现箭头型透明溶血区。
4.10.2方法：在羊血或马血琼脂平板上，先以β-溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种。再将待检菌和前一划线作垂直接种，两者应相距1cm，于35℃孵育18~24h，观察结果。每次试验应做阴阳性对照。
4.10.3结果：两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。
10.4应用：主要用于B群链球菌（阳性）的鉴定，其他链球菌均为阴性。
4.11．石蕊牛乳试验
4.11.1原理：由于牛乳内含有丰富的蛋白质和糖类，各种细菌对这些物质的分解能力不同，故可有数种不同反应，用以鉴别细菌。
4.11.2方法：将待检菌接种于石蕊牛乳培养基中，若为芽胞梭菌，要在培养基中加入无菌铁末，置35℃孵育18~24h，必要时可延长至14d。观察结果。
4.11.3结果：
4.11.3.1产酸：发酵乳糖产酸，使指示剂变为粉红色。
4.11.3.2产气：发酵乳糖而同时产气，可冲开上面的凡士林。
4.11.3.3凝固：因产酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。
4.11.3.4胨化：将凝固的酪蛋白继续水解为胨，培养基上层液体变清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。
4.11.3.5产碱：乳糖未发酵，因分解含氮物质，生成胺及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。
4.11.4应用：主要用于梭菌、链球菌和丙酸杆菌的鉴定。
5.抑菌试验
5.1Optochin敏感试验
5.1.1原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。
5.1.2方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5μg奥普托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱，35℃ 孵育18~24h，观察结果。
5.1.3结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于 14mm为阴性。
5.1.4应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）和其它链球菌（耐药）的鉴别。
5.2．杆菌肽敏感试验
5.2.1原理：A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。故此试验可对链球菌进行鉴别。
5.2.2方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U的杆菌肽纸片，置35℃ 孵育18~24h，观察结果。
5.2.3 结果：抑菌圈直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。
5.2.4应用：主要用于A群和非A群链球菌的鉴别。从临床分离的菌株中有5%~15%非 A群链球菌也对杆菌肽敏感，如6%的B群链球菌、7.5%的C群链球菌和G群链球菌等。
5.3．新生霉素敏感试验
5.3.1原理：金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低浓度新生霉素所抑制，表现为敏感，而腐生葡萄球菌则表现为耐药。
5.3.2方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于M-H琼脂平板或血平板上，在平板中央贴含5μg/片新生霉素诊断纸片一张，置35℃孵育16~18h，观察结果。
5.3.3结果：抑菌圈直径大于16mm为敏感，小于或等于16mm为耐药。
5.3.4应用：主要用于葡萄球菌某些种的鉴定。
5.4O/129试验
5.4.1原理：O/129（2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。
 5.4.2方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10μg/片及150μg/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育18~24h，观察结果。
5.4.3结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。
5.4.4应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属和气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。
5.5氰化钾试验
5.5.1原理：氰化钾可抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾和铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。
5.5.2方法：将待检菌接种于氰化钾培养基中，同时接种一支不含氰化钾的对照培养基，置35℃孵育24~48h，观察结果。
5.5.3结果：细菌在氰化钾培养基中生长的（不受抑制）为阳性，不生长（抑制）为阴性。
5.5.4应用：肠杆菌科中的沙门菌属、志贺菌属和埃希菌属细菌的生长受到抑制，而其它各菌属的细菌均可生长。
6.其它试验
6.1．克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验
6.1.1原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面和底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时和培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。
6.1.2方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵 育18~24h，观察结果。
6.1.3结果：常见的KIA反应有
6.1.3.1斜面碱性/底层碱性：不发酵碳水化合物，系不发酵菌的特征。如铜绿假单胞菌。
6.1.3.2斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵、乳糖（和TSI中的蔗糖）不发酵，是不发酵乳糖菌的特征，如志贺菌。
6.1.3.3斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵并产生硫化氢，是产生硫化氢不发酵乳糖菌的特征。如沙门菌、亚利桑那菌、枸橼酸杆菌和变形杆菌等。
6.1.3.4斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖（和TSI中的蔗糖）发酵，是发酵乳糖的大肠菌群的特征，如大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌属。
 6.1.4应用：鉴别肠道杆菌用。KIA或TSI对初分离出的、可疑为革兰阴性杆菌鉴定特别有用。其反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分，也可作为观察其他培养基反应的有价值的质控依据。
6.2．氢氧化钾拉丝试验
6.2.1原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。
6.2.2方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，和氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。
6.2.3结果：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。。
6.2.4应用：主要用于革兰阴性菌和易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于5~10s内出现阳性反应，有的则需30~45s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s内出现阳性，而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。

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