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小麦×玉米远缘杂交诱导小麦单倍体的研究进展

前言
运用传统的育种方式对小麦品种进行基因改良，按照小麦品种选育的常规育种程序，一般需要5-8年才能筛选出纯合的系(种)形成农艺性状相对整齐一致的稳定群体。再进行多点试验评估育种材料的适应性和商业价值，造成育种周期长、资源消耗大、延误品种的培育的严重后果[1]，且自交后的纯合品系仍包含一些杂合基因的缺陷。若引入远缘种质，由于杂F2及后代疯狂分离，使品种纯化需要更长的时间[2]。近年来随着分子生物学技术的发展及单倍体育种等手段极大提高了育种的精确性和育种效率。为了解决育种周期长的突出问题，小麦遗传育种工作者利用小麦和玉米杂交后，杂合子代体细胞中父方染色体消失[3]，获得大量的小麦单倍体植株，再进而经过染色体加倍。通常双单倍体在一个世代中就可以得到完全纯合的重组体[4]。利用小麦单倍体的加倍创建纯合双单倍体(Double haploid，DH)系，对缩短小麦育种年限，加快育种进程，提高选择效率及遗传研究等具有重要意义[5]。由于单倍体育种手段尚不成熟，国内外经常出现小麦远缘杂交单倍体胚、单倍体苗的产生频率以及染色体加倍效率不稳定，加倍单倍体植株成功率相对较低的报道[6]。国内外科学家正致力于小麦×玉米远缘杂交单倍体诱导育种技术的研究和完善，希望在较短的时间周期内培育出优质、高产、广适的小麦品种。
1 小麦单倍体产生和鉴别
1.1 小麦×玉米杂交系产生
单倍体培养途径如花药/花粉粒培养、子房/胚珠培养、远缘杂交单倍体诱导已逐渐进入品种改良迅速发展时期。目前已有200多种植物通过花粉/花药培养获得了单倍体植株，其中以茄科和禾本科居多[7]许多禾本科作物通过花粉/花药培养诱导植株再生已经获得成功，如水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦和高粱。大麦、玉米、水稻和小麦通过培养子房和胚珠使单倍体再生[8]的研究也有了很大的发展。但上述两种方法应用于普通小麦时出现成苗率低和大量白化苗的现象。
1964年，Guha和Maheshwari从曼陀罗花粉中第一次培育出单倍体植株。1975年Barelay[9]用普通小麦和球茎大麦杂交获得了高频率的小麦单倍体，但后来的研究表明由于小麦5B染色体长臂上的Kr1基因和5A染色体长臂上的Kr2基因阻止小麦和异源植物交配，造成普通小麦和球茎大麦之间的杂交存在不亲和性[10]。Zenkteler[11]最早报道了六倍体普通小麦和玉米之间的远缘杂交。1986年Laurie等[12]利用小麦×玉米成功诱导出小麦单倍体植株，并通过细胞学观察证实了小麦×玉米得到的幼胚是单倍体胚，小麦授玉米花粉1d后的杂种胚存在21条体积较大的小麦染色体和l0条体积较小的玉米染色体，授粉3-6d的杂种胚中仅有2l条小麦染色体和微核。在最初的3次细胞分裂中，来自父本玉米的染色体被完全排除掉，形成了仅有21条母本小麦染色体的单倍体胚。利用小麦品种间代换系进行进一步比较，小麦×玉米的受精频率不受小麦所携带的Kr1和Kr2基因的影响，Kr基因在小麦和玉米杂交中是不敏感的。Zhang J等[13]比较分析了小麦×玉米杂交和自花授粉的小麦植株的胚胎石蜡切片发现胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段,便逐渐退化。Mochida等[14]观察证实了小麦杂交24-28h后受精卵细胞分裂后玉米的染色体迅速消失的情况。
1.2小麦单倍体的方法和鉴别
小麦单倍体主要有三种方法：花药培养法、球茎大麦法和玉米杂交法。花药培养法因受小麦基因型限制导致成苗率较低，以及因产生大量白化苗而限制了应用。球茎大麦法中位于小麦5B、5A染色体上的Kr基因对小麦基因型存在明显的选择性，提高了外源植物和之交配的难度。而且小麦和球茎大麦杂交后，球茎大麦染色体并不完全消失，来自父本的某些不利基因的进入受体小麦中。利用小麦和玉米远缘杂交诱导小麦双单倍体主要依赖于单倍体胚产生频率、单倍体植株的获得频率以及单倍体植株的加倍成功率。由于原胚的分裂和2,4-D的作用获得了小麦单倍体胚方法的广适性更好。
通过解剖开外种皮后，白色的胚漂浮在种皮包被的水囊里，而胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段，形成缺乏胚乳的种子是鉴别小麦多元单倍体胚的基本特征[15]。鉴定小麦(Triticum aestivum L.)×玉米(Zea mays L.)产生的杂种子代的单倍性，采用形态学和细胞学鉴定相结合的方法发现杂种子房内均无胚乳，仅在少数子房内观察到1个游离的球形幼胚且发育成植株后在花期花药退化或花粉败育[16]，可作为杂交后代单倍性的形态学标记。
2.1转化率影响因素
2.1 亲本的选配
小麦和玉米基因型对多元单倍体胚形成到小苗再生具有显著的影响。Suenaga[17,18]等评估来自不同地理区域(亚洲、欧洲、北美和澳大利亚)的47个小麦基因型55个玉米品种(品系)，其产生胚的能力上存在显著的基因型差异。研究结果显示不同组合的单倍体胚平均形成率是15.2%，但胚形成率变化幅度相当大(以色列低聚糖麦秆的形成率为0.9%，日本Hiyoku-komugi的形成率为35.8%)。
2.1.1 小麦基因型
Inagaki等[19]认为不同小麦基因型的单倍体得胚率存在明显差异，Kisan N.S.等[20]、陈新民等[21]认为不同小麦基因型对单倍体得胚率无显著影响。蔡华等[2]用100多个小麦F1代组合和玉米杂交结果显示不同基因型小麦对得胚率存在显著差异,最高单倍体得胚率达3O%以上，最低在5%以下。小麦基因型之间的差异对杂交诱导的影响最为重要。张新玲等[22]验证得玉米花粉诱导六倍体普通小麦得胚率为5.4%，明显高于四倍体。杀配子染色体杂种材料和玉米的杂种成胚率有待研究。利用杀配子染色体材料的杂交后代不同基因型小麦材料(母本)和滇超甜2号玉米(父本)杂交杂种成胚率无显著差异[23]。
2.1.2 玉米基因型
相比小麦基因型，玉米基因型操纵主动性更强，良好的玉米基因型明显提高诱导单倍体得胚率。不同基因型花药诱导愈伤组织的诱导率差异很大[24]。陈新民等[5]用三个玉米单交种给同一小麦品种授粉，结果得胚率在13.3-33.1%，且各处理组合间存在显著差异。蔡华等[2]用35个小麦F1代组合和4个不同玉米基因型进行杂交，结果也很明显。同时，王广金[25]用甜玉米，糯玉米，普通玉米三种基因型和两个小麦杂交组合进行试验，得到平均得胚率为甜玉米(8.71%)>糯玉米(6.54%)>普通玉米(5.65%)。所以发掘和选择具有高受精率、易成胚的玉米基因型是研究中的关键环节。
2.2 生长环境
自然生长环境条件对得胚率影响最大的因素是温度和光照。Campbell等[26]研究结果显示对单倍体诱导的最佳温度为白天22℃．夜晚17℃；最佳光强为1000mol-1.m.s.PAR，16h/d。因此，控制授粉后15d左右的光温条件对于幼胚的生长发育非常重要。光照是影响得胚率的重要因素，连续阴雨造成的极端寡照显著降低小麦单倍体胚的得胚率[27]。此外，小麦的生长环境的湿度、生长期间的水肥及植株生理状态也会影响到单倍体得胚率和出苗率。在低湿度状态下平均生产的颖果数和胚数是高湿度状态下的2倍，而且单倍体株数较多，因为低湿度状态下胚细菌感染率仅为5%远小于高湿度状态下的50%[28]。
在最适宜培养条件下，室内离体培养法平均成胚率(23.6%)高于常规杂交法(18.1%)，且以2O℃、光照3000Lx、12h/d、相对湿度7O%条件下离体培养杂交穗14d获得的成胚率最高(28.6%)，授粉后获得最高成胚率的T>1O℃有效积温在187.9-254.9℃之间[29]。一定的积温对于诱导成功率有促进作用。
2.3 花粉活力
玉米和小麦花期相遇是利用小麦×玉米诱导小麦单倍体、进行小麦育种的前提[30]。正常生育条件下两者生长状况差异巨大。冬春季适合小麦生长，玉米一般植株矮小，花粉量少，育性差；而在的夏秋季节，玉米生长旺盛，小麦常因春化条件及环境因素使得植株整体农艺性状不佳，授粉状态不理想。生产上常采用分期播种并配合适当的设施条件以及加强肥水管理等方法来调节花期，促使植株健壮，提高花粉活力，并可对玉米进行温床育苗、大田移栽。蔡东明等[30]对陕西关中地区冬小麦和玉米杂交的花期调节进行了研究，认为1月27日至2月7日室内营养钵分期点播，3月l日移栽至大棚，在小麦花期便可获得持续的、多类型玉米花粉，确保杂交顺利进行。供体花粉的活力及受体柱头识别、接受异源花粉的能力决定杂交的最终成败。王艳哲等[31]发现常温条件下玉米花粉具有授精能力，高温(32-35℃)条件花粉失水干枯，生活力很容易丧失，并且抑制高温花粉的萌发和花粉管生长，导致花粉败育。
3 高效规范的实验技术
3.1 玉米花粉授粉技术
嫩龄授粉和重复授粉是提高远缘杂交结实率，克服小麦远缘杂交不亲和性的有效措施。根据众多学者关于小麦×玉米杂交诱导单倍体技术试验结果论述[21， 32]，最适宜的授粉时间是在小麦开花前1-2d当柱头顶部略分叉呈毛茸状时进行。玉米花粉对小麦的授精能力随花期的延长而降低，晴天上午9：00～10：00采集新鲜玉米花粉给去雄的小麦穗授粉，活力最高、效果良好。混合玉米花粉诱导小麦单倍体得胚率4.6%,高于单一玉米花粉[22]。24h后重复授粉可以使不同穗位的小花也能在适宜时期接受玉米花粉、增强柱头接受异源花粉的能力[2]。因为小麦玉米花期不遇，可将花粉暂时保存。新鲜的玉米花粉可在l-5℃低温干燥环境中储存2-3天不影响其授粉效果[31]；干燥处理后在-80℃条件下低温可较长时间储藏玉米花粉并可成功地为小麦花授粉，但胚形成率比新鲜花粉低。Paula Filomena等[33]认为小穗中部进行小麦和玉米的属间杂交能提高所获得的加倍单倍体品系的频率。王霖等[34]使用小麦不育系处理在单倍体幼胚数、得胚率、双倍体苗数、双倍体幼苗占授粉小花数的百分率指标上都明显高于人工去雄的处理。玉米花粉诱导雄性不育系的得胚率为3.2% ，高于常规材料[22]，应探索高效适宜的雄性不育材料。
3.2 诱导技术
3.2.1 2,4-D最适浓度
胚乳败育或异常退化，使得杂种幼胚在生长发育的早期得不到胚乳的营养供应而在植株上天亡。为减轻这种危害，完成小麦授玉米花粉后必须用激素处理以促进细胞分裂和发育、诱导小麦单倍体胚形成。孙敬三等[35]认为2,4-D能明显促进无胚乳的单受精胚胎的生长发育，可有效延长幼胚在植株上的发育时间，从而获得大量可供培养的幼胚。Suenaga[18]研究了不同类型、不同浓度激素(包括2,4-D、NAA、IAA、BA、KT、ZT、GA3、ABA)的处理效果，发现在小麦最上茎节注射100mg/L的2,4-D溶液1 ml效果最好,王广金[25]用2,4-D溶液处理杂交穗得到相同的结果。用该浓度重复处理柱头2-3次能有效提高得胚率[2,32]。小麦散粉前授玉米花粉后用250mg/L的2，4-D处理得胚率最高[36]。也有试验[5,22]认为150mg/kg是最适宜的2,4-D浓度。2,4-D处理授粉后的杂交穗或小花促进子房发育膨大，直至能进行离体培养。进一步研究发现小麦×玉米远缘杂交时施用2,4-D+AgNO3的效果好于单独施用2,4-D，其机理可能是加入硝酸银可以阻止2,4-D诱导处理的副作用产物乙烯利，减缓脱落过程，容易形成单倍体胚。
3.2.2 2,4-D处理方法
目前2,4-D浓度的处理方法主要有节间注射法、小花滴注法、喷施柱头法、整穗浸渍法。在成胚率方面，喷施柱头法(15.65%)>节间注射法(11.31%)>整穗浸渍法(10.02%)[37]。普遍认为2,4-D喷施柱头法具有胚率高、操作简易等优势。胡远林[38]认为授粉后1h首次进行2,4-D穗下节注射+子房滴注的单倍体植株获得率和获得效率分别达到37.50%和3.33%，诱导效果最好。但试验操作中发现，用2，4-D喷施柱头或小花滴注后套袋隔离后，纸袋内的湿度过大而在柱头上长出许多霉菌。遇到温度较高时，杂交穗上还会滋生大量蚜虫，使田间操作及管理困难，得胚率严重下降。生产上常用节间注射法进行2，4-D处理。
3.2.3 纳米水
纳米水处理的平均诱导效率明显优于对照处理。纳米水处理的单倍体植株获得率和获得效率显著高于未使用纳米水的处理[37]。因此，使用纳米水处理在小麦×玉米远缘杂交中能明显提高小麦单倍体诱导效率。
3.3 胚拯救
缺乏胚乳在情况下，前期胚在植物体内发育至l5-20天，便会出现严重的营养缺失甚至夭折，需要及时地通过组织培养进行胚拯救。大田中胚的变异率较高不易控制、得胚率极低，多使用冷温室培养和割穗培养两种方式。
3.3.1 冷温室培养
冷温室培养可以控制低温环境在20℃以下和70%左右的湿度，得胚率较高；普遍认为，在培养液中补充2,4-D是单倍体胚形成到幼苗再生的最有效方法[39]，在小麦×玉米杂交后24 h从茎基部剪下整株，在含有100mg/L2,4-D+40g/L蔗糖+10mg/L硝酸银+8mL/L亚硫酸+3mL/L磷酸二氢钾的培养液中培养,昼夜温度为20/5℃左右，得胚率比田间生长高2倍。也有报道认为离体穗培养过程中单独使用麦草畏或麦草畏和2,4-D、毒莠定和2,4-D结合使用得胚率能得到极大提高[18]。
3.3.2 割穗培养
此法能够人为控制光照、温湿度和胚形成的激素和碳源，得胚率最高，但需要每天更换营养液。适当延长杂交胚在植株上的生长时间，在割穗培养20d时剥出的胚体积大，成苗率高。在白色种皮渐显失水回缩时，将种子剥出，在10%次氯酸钠中灭菌15min，解剖镜下剥离单倍体幼胚。将杂交穗离体培养在包含改进的有机营养补中，如：1/2MS+IAA0.2mg/L+6-BAP0.2mg/L培养基中培养[36]。一般用改良B5培养基的平均诱导效率明显优于1/2MS培养基[40]。张新玲[22]首先在4℃条件下暗培养5d，然后在24-25℃及16h光照条件下培养2周左右，90%以上的胚均能萌发成正常植株。采用未加任何激素的1/2MS培养基，选取14d胚龄0.4-1.0mm的幼胚离体培养，成苗率为81%，显著高于其它培养基进行幼胚离体培养的成苗率。杂交穗离体培养的得胚率（31.6%）比田间自然生长（9.6%）割穗培养的最佳时期为授粉24h。不同的穗培养液配方对颖果结实率和得胚率均有明显影响，在培养基中添加磷酸二氢钾有利于提高颖果结实率和得胚率[39]。
3．4 单倍体加倍技术
顾坚等[41]认为加倍前对分蘖节进行切口处理的单倍体苗加倍率和加倍效率可明显提高。根据不同剂量和不同处理持续期形成了3种秋水仙碱处理方法：离体分蘖注入、对分离分蘖的处理和离体处理。培养基中添人0.1%的秋水仙碱的持续时间不影响植株再生频率，而0.2%和0.3%的较高秋水仙碱浓度在较长的处理持续时间(36h和48h)情况下却造成了植株再生频率(PRF)和植株形成效率(PFE)显著下降[42]。秋水仙素浓度越高，毒害作用越大，植株成活率也越低。对分蘖苗进行浸根处理时，会产生大量的烂根现象。对单倍体苗加倍处理时，给予持续适宜的O2供应可提高平均加倍率。
培养萌发的幼苗需要在15℃左右条件下锻炼半个月然后转育到室外的小钵中。使胚萌动后分化出适宜分蘖数，然后把具有2个以上分蘖、3片叶以上的单倍体幼苗存l-7℃环境春化一个月，取出缓苗2d后，对2-3个分蘖阶段的单倍体幼苗用秋水仙素处理。将单倍体壮苗的根部修剪后留下2-3cm，20-25℃温度下在0.5-1.0g/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亚+0.5g/L的吐温-20溶液中浸泡5-7h[43]。最高获得89.6%以上的加倍处理效率。秋水仙素处理并冲泡一昼夜后，种植在控温温室生长，秋冬季节得到种子，一年实现两代的培育，第一代诱导胚形成，第二代单倍体苗加倍后自交形成纯合六倍体种子。也常采用秋水仙素处理单倍体植株根部的方法进行加倍。Mujeeb-Kazia等[44]利用0.05%-0.1%的秋水仙素加入2%的二甲基亚枫(DMSO),在2O-25℃ 条件下处理单倍体植株。6h后清水冲洗3O-45 min再移栽获得6O%-7O%的加倍率。闫林等[45]证实在不同二甲基亚砜(DMSO)处理中，2%体积分数的DMSO最佳处理平均得胚率最高为15.8%且和最低处理（7.1%）差异显著。冬小麦材料和玉米杂交胚率存在差异，如：小偃22得胚率较高[32]。
4. 小麦玉米杂交系的现存问题
4.1 小麦玉米基因型有待深入研究
研究发现胚形成率变化幅度相当大[26,39]。育种者需要调查亲本基因型对单倍体胚形成到植株再生的影响以评估杂交亲本的实用性。多数研究认为小麦、玉米基因型的交互作用极大地影响了多元单倍体胚的形成和再生。也有只有玉米基因型影响着胚形成和发育的观点，有待进一步研究。许多小麦栽培品种对于可交配性障碍是不敏感的。玉米基因型对单倍体胚的形成和小穗、小苗再生都具有显著影响。为了研究玉米和小麦基因型对小麦单倍体生产的影响，Kour等[46]从5个抗冻型和2个冻害敏感型小麦栽培种杂交的l0个F1代材料和5个玉米基因型进行远缘杂交，方差分析显示小麦亲本基因型、玉米基因型以及交互作用对于单倍体生产具有极大的影响。杂交诱导后代主基因遗传率较低，非遗传因素对小麦材料单倍体胚成胚率的影响更大[47]。
4.2 DH系的稳定性不明确
关于DH系稳定性的研究十分有限，Suenaga等[17]评价了110个小麦×玉米远缘杂交的小麦DH系，结果发现l5个双单倍体2代发生了极端矮小、生育力低、穗型改变等性状变异。在DH系2代植株中或存在异质性/杂合性。并研究推断，在DH系中检测的的许多变异是由于秋水仙素处理的结果。Kammholz等[48]从来源于7个杂交的6个麦谷蛋白基因位点发现了预期的正常分离类型，说明小麦玉米杂交系通过世代交替是稳定的。此外，Lefebvre等[49]也证实了1BL一1RS染色体通过小麦玉米系杂交正常分离，但是花药培养的单倍体后代偏离1：1。
应用方面，王子宁等[50]利用关东107和白火麦的杂种F1进行单倍体诱导，从5O个DH系中获得了6个纯合的糯性小麦株系。孙敬三等[51]用含有Tal太谷核不育基因的小麦和超甜玉米杂交，经幼胚拯救和染色体加倍，创造了自然界不存在的纯合显性太谷核不育小麦新种质(Ta1Ta1)。刘辉等[52]对小麦×玉米所获得和F2代籽粒进行蛋白质电泳分析，发现杂交后代的蛋白质谱带主要集中在高分子量的麦谷蛋白区域，为提高和改善面粉品质及面包烘烤特性小麦品质提供了新的思路。利用小麦×玉米产生的纯合DH植株，能直接反映F1配子中基因的分离和重组和遗传结构，快速准确构建理想的遗传作图群体，极大的促进小麦遗传图谱的构建QTL分析以及多基因聚合育种等研究。
4.3 优势评估
研究总结小麦玉米杂交系如下优势：高效、较少的配子克隆变异、较低的时间成本、较小的基因依赖性。目前小麦玉米杂交系、雄核发育及球茎大麦技术诱导单倍体胚的优劣差异对比研究较少。Fedak等[53]研究发现小麦玉米杂交系较花药培养和球茎大麦技术具有较少的基因型依赖反应。小麦×玉米杂交单倍体胚形成率高于大多数小麦×球茎大麦杂交系。Mahmoodi-Ghehsareh等[54]报道花药培养70.7%的再生植株是白化苗，仅29.2%是绿的，而小麦玉米杂交产生植株全是绿的。在AFLP玉米传粉的杂交品系和花药培养的杂交品系显带模型中发现较低的变异频率，分别为0.18和0.21%[55]。需要在种质和方法上深入探索。Oury等[56]少数研究显示花药培养中胚形成率较小麦×玉米杂交系要高，但许多花药培养派生出的胚发芽率低，白化严重。用小麦×玉米诱导单倍体任何基因型小麦都可以得到单倍体植株[24]，且小麦×玉米杂交法的效率约是花药培养3-4倍。大多数调查显示小麦玉米杂交系优于雄核发育，杂交派生出的双单倍体群体代表了亲本配子无偏差分配，充分体现小麦×玉米杂交法的高效性和准确性。
5.前景展望
在小麦遗传育种领域，随着分子标记技术的日趋成熟，标记所用遗传群体也应更加精确。因为F、BC、RI等群体不具有永久性而且构建周期长，限制了实践中广泛应用。小麦×玉米杂交组合对于高效改进未来小麦育种程序具有巨大的潜力。但单倍体胚和植株产生频率以及染色体加倍效率还不稳定，大田培养情况下提高和稳定胚诱导成功率更加艰巨，仍需继续探索；转座因子插入后的基因突变产生可识别的表现型，在不同地点和年份进行稳定性鉴定；利用小麦×玉米受精卵的杂合性创新分子通道或在杂交染色体消除前通过X射线照射等方法诱导促进基因组间易位以转移玉米有效的转座因子以及C4循环基因进入小麦背景，产生的价值无法估量；结合分子设计开发培育综合玉米优良性状的小麦新品种；通过结合聚合杂交和分子标记辅助选择可以不断完善。同时远缘杂交也极有可能从相关的野生种中向小麦中转入优良的目标基因。利用克隆进行分子分析和生物育种核心技术及小麦×玉米远缘杂交生理机制研究，能够创造出适宜的环境条件，控制调节适宜的植物激素资源，提高小麦×玉米远缘杂交的胚形成率、成苗率和单倍体加倍成功率。在单交F2代或复交F1代筛选优良单株和玉米杂交，提高获得优良DH植株的频率。
现代生物学技术和常规育种技术有机结合，缩短育种周期、高效改进小麦育种程序、加快育种进程培育优良农业生物新品种，是确保国家食物安全和提高农业国际竞争力的重要途径。我们应投入更多精力深入探讨小麦×玉米远缘杂交技术及单倍体育种，以推进小麦作物的基因组研究以及小麦育种革命。
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