山药多糖对葡萄糖苷酶抑制实验设计.doc

山药多糖提取物对葡萄糖苷酶的抑制实验

2 0 1 6 年5 月
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一．所需试剂
（1）PBS缓冲液  
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至6.8，最后加蒸馏水定容至1L
称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至6.8，加水定容至1L，常温保存备用。
实际配制500ML即可。
（2）3 mmol/L 谷胱甘肽溶液
谷胱甘肽分子量：307.32，称取46.1mg谷胱甘肽定容至50ml蒸馏水中，即为3 mmol/L 谷胱甘肽溶液。
（3）0.01 mol/L PNPG 溶液
4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷分子量：301.25,称取150.6mg定容至50ml蒸馏水中，即为0.01 mol/L PNPG 溶液。
（4）0.2 mol/L Na2CO3 溶液
Na2CO3分子量：105.99，称取2.12g定容至100ml,即为0.2 mol/L Na2CO3 溶液
一． 实验流程
1】酶活性的测定
1.检测样配置
取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、
3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL，
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min 后，
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀，
37 ℃保温继续反应10 min，
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液800μL 终止反应，
于400 nm 波长处测定吸光值.
2. 参比配置
取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、
3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL，
水60 μL，
37 ℃保温10 min 后，
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀，
37 ℃保温继续反应10 min，
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液800μL 终止反应，
于400 nm 波长处测定吸光值.
检测样吸光值为

参比吸光值为

2】多糖提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定
1.待测样配置
A
配置浓度为2 mg/mL 的多糖酸性水提取物
分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中
各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL
加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀
37 ℃保温继续反应10 min
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应
于波长400 nm 处测定吸光值
B
配置浓度为2 mg/mL 的多糖酸性氯化钠提取物
分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中
各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL
加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀
37 ℃保温继续反应10 min
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应
于波长400 nm 处测定吸光值
C
配置浓度为2 mg/mL 的多糖中性水提取物
分别取溶液20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中
各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL
加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀
37 ℃保温继续反应10 min
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应
于波长400 nm 处测定吸光值

2.空白样配置
取水100 μL
各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL
加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀
37 ℃保温继续反应10 min
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应
于波长400 nm 处测定吸光值
空白样吸光度

3.参比配置、
分别取水20、40、60、80、100、150、200 μL，于10mL塑料试管中
各加入67 mmol/L pH 6.8 的磷酸缓冲液至1.4mL
加3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL
0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，
37 ℃保温10 min
加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀
37 ℃保温继续反应10 min
加入0.2 mol/L Na2CO3 溶液0.8 mL 终止反应
于波长400 nm 处测定吸光值
对α-葡萄糖苷酶活抑制率计算公式如下：

注：A 样品为加有样品反应后的吸光度；A 本底为只加有样品的吸光度；A 空白为不加入样品反应后的吸光度。
本底吸光度（磷酸缓冲液吸光度）

酸性水提
编号
吸光值
抑制率
IC50 值
20

40

60

80

100

150

200

酸性氯化钠提
编号
吸光值
抑制率
IC50 值
20

40

60

80

100

150

200

中性水提
编号
吸光值
抑制率
IC50 值
20

40

60

80

100

150

200