SN∕T 3557-2013 黄热病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 黄热病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法犚 犜 犘 犆 犚犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犚 犜 犘 犆 犚犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳狔 犲 犾 犾 狅 狑犳 犲 狏 犲 狉狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 师永霞、 洪烨、 丁国允、 相大鹏、 孙薇、 李小波、 郑夔、 黄吉城、 幸芦琴、 郭波旋、钟玉清、 李燕。犛 犖犜 黄热病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了国境口岸黄热病检测的生物安全要求， 标本的采集、 运输和保存， 标本的处理， 黄热病毒常规 检测和实时荧光 检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员或媒介蚊虫携带黄热病毒的分子生物学检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（ 卫生部）缩略语下列缩略语适用于本文件。 ： 反转录聚合酶链反应实时荧光 ： 实时荧光反转录聚合酶链反应 值： 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 ： 核糖核酸 ： 荧光染料， 一种荧光报告基团术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 黄热病狔 犲 犾 犾 狅 狑犳 犲 狏 犲 狉由黄病毒科、 黄病毒属的黄热病毒（ ； ） 引起的急性传染病， 埃及伊蚊（犃 犲 犱 犲 狊犪 犲 犵 狔 狆 狋 犻） 是主要的传播媒介， 主要流行于非洲和中、 南美洲，月份月份的病例较多。临床特征有发热、 剧烈头痛、 黄疸、 出血和蛋白尿等。 黄热病毒狔 犲 犾 犾 狅 狑犳 犲 狏 犲 狉狏 犻 狉 狌 狊属于黄病毒科黄病毒属的病毒， 颗粒呈球形， 直径 ， 外有脂蛋白包膜包绕， 包膜表面有刺突。病毒基因组为单股正链 ， 相对分子质量约为 ， 长约 。生物安全要求按照 和 人间传染的病原微生物名录 的要求， 黄热病毒相关材料的生物安全要求如下：犛 犖犜 黄热病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全级（ 或 ） 实验室内进行； 黄热病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全级（ ） 实验室内进行； 黄热病毒的病毒培养物运输包装分类为类，编号为 。标本的采集、 运输和保存 人血清无菌采集疑似病例发病天内静脉血 ， 室温静置 使其凝固， 犵离心 ，收集血清于无菌螺口塑料管中， 用耐低温油性记号笔记上编号， 低温送到实验室检测。如 内不能送到实验室， 将血清置于 保存。 蚊虫采集吸过血的伊蚁或其他可疑媒介蚊 城市型黄热病的主要传播媒介为埃及伊蚊， 丛林型黄热病的传播媒介主要有趋血蚊属（犎 犲 犿 犪 犵 狅 犵 狌 狊） 和煞蚊属（犛 犪 犫 犲 狋 犺 犲 狊） ， 用 葡萄糖液喂养蚊虫至胃血完全消化后， 按蚊种及捕获地点分组装至有螺旋帽的无菌管中， 用耐低温油性记号笔记上编号， 低温运输或 以下保存待检。标本的处理 血清标本血清标本直接进行分子生物学核酸的提取， 如 内不能及时检测应存放在 冰箱。 蚊虫标本 在冰上操作。从 容器中取出蚊虫标本， 倒入研磨器中。 加入 液吹洗， 弃去液体后加入 标本处理液（ 配方参见附录） ， 反复研磨至组织碎片基本消失。 将研磨液吸入 离心管， 配平后置预冷的离心机上， 犵离心 。 取上清液进行分子生物学核酸的提取。黄热病毒的犚 犜 犘 犆 犚检测 主要仪器本方法使用的主要仪器如下： 扩增仪； 千分之一天平； 超净工作台； 级生物安全柜； 高压灭菌锅； 低温高速离心机： 最大离心力 犵； 电泳仪； 凝胶成像分析系统；犛 犖犜 旋涡振荡器； 冰箱：、 和 ； 移液器： 、 、 、 和 ； 恒温水浴锅。 主要试剂除另有规定外， 所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下： 核酸提取试剂： 用美国 公司 ）提取病毒核酸； 试剂： 美国 公司 ）； 无 酶的 水； 检测的引物： 上游引物 （ ） 和下游 引 物 （ ） ，预 期 扩 增 片 段 为 ； 电泳缓冲液（ ） ， 配方参见附录； 溴化乙锭（ ） ： ， 使用浓度为 ， 配方参见附录。 检测步骤 核酸提取 吸取 血清样本或蚊虫样本处理液加入溶解的 裂解液 。 脉冲混匀 ， 置于室温 。 短暂离心， 加入 乙醇（ ） 脉冲混匀 。 短暂离心。 将 旋转柱置于 收集管中。吸取 中溶液 转移至旋转柱上， 犵离心 ， 将旋转柱放至干净的收集管上， 丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖， 重复 。 打开旋转柱盖， 加入 洗液 ， 盖紧盖子， 犵离心 。将旋转柱放至干净的收集管上， 丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖， 加入 洗液 ， 盖紧盖子， 犵离心 。将旋转柱放至干净的收集管上， 犵再离心 。将旋转柱放至干净的 离心管上， 丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖， 加入 室温平衡的缓冲液 。 盖紧盖子， 室温放置 。 犵离心 。 收集滤出液， 用于 扩增。 或 储存 。 犚 犜 犘 犆 犚检测）由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 准备 反应液， 设 反应体系， 每个待检标本反应液的组成为： 缓冲液 ， ， ， ， ， 无 酶的 水 ， 模板。同时设立阴性对照和阳性对照， 阳性对照模板为根据黄热病毒核苷酸序列（ 登录号 病毒 之间的片段） 体犛 犖犜 外转录的 片段； 阴性对照模板为不含黄热病毒核酸的标本或无 酶的水。 将 反应管置于 扩增仪上进行操作， 反应程序为： 逆转录 ， 预变性 ； 变性 ， 复性 ， 延伸 ， 个循环； 延伸 ；。 凝胶电泳扩增结束后， 在扩增产物中加入 上样缓冲液， 用含 溴化乙锭的 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 用凝胶成像系统照相记录结果。 结果判断 质量控制反应结果应同时符合以下个条件： 阴性对照未出现特异性条带； 阳性对照出现预期 大小的扩增条带。 结果分析在实验结果有效情况下， 如待测样品出现预期 大小的扩增条带， 则可判断待测样品黄热病毒核酸 阳性， 判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认； 如待测样品中未出现预期大小的扩增产物， 则可判断待测样品黄热病毒核酸 阴性。 测序对于首发病例， 应将 扩增产物进行序列测定， 确定其碱基组成。使用 分析其与已公布的黄热病毒序列的同源性， 判断扩增产物是否为黄热病毒核酸。实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 主要仪器本方法使用的主要仪器如下： 荧光定量 仪； 超净工作台； 级生物安全柜； 高压灭菌锅； 低温高速离心机： 最大离心力 犵； 旋涡振荡器； 冰箱：、 和 ； 移液器： 、 、 、 和 。）由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 主要试剂本方法使用的主要试剂如下： 核酸提取试剂： 用美国 公司 ）提取病毒核酸；犛 犖犜 实时荧光 通用试剂： ， 美国 公司产品）； 无 酶的 水； 引物和探针： 引物和探针序列见表。表黄热病毒实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测的引物和探针引物探针名称序列（ ）扩增片段 预期扩增片段为 注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 核酸提取见 。 加样准备实时荧光 反应液， 设 反应体系， 每个待检标本反应液的组成为： 缓冲液 、 、 、 、 、 模板 。同时设立阴性对照和阳性对照， 阳性对照模板为根据黄热病毒核苷酸序列体外转录的 片段， 阴性对照模板为不含黄热病毒核酸的标本或无 酶的水。 实时荧光犚 犜 犘 犆 犚扩增反应在不同的荧光定量 仪上，犜 犪 狇 探针实时荧光 的反应条件略有不同。以 或 荧光定量 仪为例， 实时荧光 检测扩增程序为： ， ； ， （ 收集荧光信号） ， 个循环。如使用其他仪器， 应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。 结果分析 阈值确定阈值确定的方法对所有的样品都是统一的， 一般是以荧光 反应的前 个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 以本底信号标准差的 倍作为荧光阈值， 以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（ 值） 。 质量控制反应结果应同时符合以下个条件： 阴性对照无扩增曲线； 阳性对照 值 并有明显扩增曲线。 结果判定 根据以下条件进行结果判定： 无明显扩增曲线， 判断为黄热病毒荧光 检测阴性；犛 犖犜 有明显扩增曲线， 且 值 ， 判断为黄热病毒荧光 检测阳性； 有明显扩增曲线， 且 值 的标本应重做， 重做后只要出现扩增曲线， 则判断为黄热病毒荧光 检测阳性， 否则为阴性。 阳性标本的确认： 荧光 结果阳性的标本可进一步进行 扩增， 对于首发病例， 应对扩增片断进行测序和序列比对， 确认是否为黄热病毒核酸阳性。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）试剂的配制犃 标本处理液（ ） ： 在新鲜配制的 中加入 热灭活 的胎牛血清 、庆大霉素（ ） 、 两性霉素（ ） 和 青链霉素（ 青霉素 、 链霉素 ） ， 用 碳酸氢钠溶液调至 。犃 电泳缓冲液（ ） ： 称取 碱， 溶于 的重蒸水中， 加入 （ ） 、 冰乙酸， 至充分溶解后用水定容至， 室温储存。使用前用重蒸水稀释至 进行倒胶和 电泳。犃 溴化乙锭（ ） ： 在 水中加入溴化乙锭， 磁力搅拌数小时以确保其完全溶解， 然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中， 保存于室温。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准黄热病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元