动物细胞培养.pptx

细胞培养的相关概念细胞培养的相关概念v细胞培养：细胞培养：v细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。种培养技术。v传代：传代：v细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。到新的培养器皿中。第1页/共22页v原代培养：原代培养：从动物机体取出的进行培养的细胞群。除从动物机体取出的进行培养的细胞群。除肿瘤细胞以外，原代培养的细胞生长比较缓慢，而且肿瘤细胞以外，原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。代以内）停止生长。v传代培养：传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。分离一次再培养称为传一瓶即称为传代或传代培养。分离一次再培养称为传一代。代。v细胞系：细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。v细胞株：细胞株：从原代培养或细胞系中获得的有特殊性质或从原代培养或细胞系中获得的有特殊性质或标志的细胞。在培养过程中其特征始终保持。标志的细胞。在培养过程中其特征始终保持。第2页/共22页(一一)培养细胞的特性培养细胞的特性(一一)培养细胞的特性培养细胞的特性1.培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式v贴贴附附生生长长：必必须须贴贴附附于于支支持持物物表表面面才才能能生生长长。是是多多数数体体外外培培养养细细胞胞的的基基本本生生长长特特点点。见见于于各各种种实实体体瘤瘤细细胞胞。虽虽然然血血细细胞胞如如淋淋巴巴细细胞胞在在活活体体体体内内并并无无聚聚集集的的倾倾向向并并在在体体外外可可于于悬悬浮浮状状态态中中生生长长，但但是是大大多多数数的的哺哺乳乳动动物物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长。v接触抑制及密度依赖性接触抑制及密度依赖性v悬悬浮浮生生长长：于于悬悬浮浮状状态态下下即即可可生生长长，不不需需要要贴贴附附于于支支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。第3页/共22页常用培养容器常用培养容器细胞培养瓶，微孔板，平皿等细胞培养瓶，微孔板，平皿等第4页/共22页贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法 1.吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液 2.加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微（显微镜下动态监测）。镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。胞，形成细胞悬液。5.吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。培养瓶内。7.将后者放入培养箱中培养。将后者放入培养箱中培养。第5页/共22页v细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：v 1潜伏期潜伏期（Latent Phase）：）：v 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关基成分和底物的理化性质等密切相关 v 2指数增生期指数增生期（Logarithmic growth Phase）：）：v这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。种实验最好的和最主要的阶段。第6页/共22页在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 35天后，天后，随细胞数量不断增多随细胞数量不断增多，最后细胞相互接触汇合成片。如培最后细胞相互接触汇合成片。如培养的是正常细胞，相互接触能抑制细胞的养的是正常细胞，相互接触能抑制细胞的增殖增殖，这种现象，这种现象称称接触抑制接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生三维空间扩展，使细胞发生堆积堆积（Piled up）。）。3停滞期停滞期（Stagnate Phase）：细胞数量达饱和密）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、积累、pH降低。此时需做分离培养即传代。降低。此时需做分离培养即传代。第7页/共22页细胞生长过程细胞生长过程第8页/共22页v人微血管内皮人微血管内皮细胞株（胞株（HMEC-1）v细胞状胞状态特征：多角形或梭形，特征：多角形或梭形，边界清晰，大界清晰，大小均匀，胞核小均匀，胞核为圆形或形或椭圆形，位于形，位于细胞中央，胞中央，汇合后呈典型的合后呈典型的铺路石路石样排列。排列。第9页/共22页v人口腔皮人口腔皮样癌癌KB细胞株胞株v细胞状胞状态与特征与特征简述：述：贴壁生壁生长细胞，呈不胞，呈不规则形状。形状。第10页/共22页(二二)培养细胞生长的条件培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要细胞的营养需要 培培养养基基：提提供供细细胞胞培培养养氨氨基基酸酸、维维生生素素、碳碳水水化化合合物、无机离子、生长因子等。物、无机离子、生长因子等。2 细胞的生存环境细胞的生存环境 温度：人类细胞一般用温度：人类细胞一般用37 气气相相及及pH：95%空空气气加加CO2的的混混合合气气体体。pH:7.2-7.4。CO2为为细细胞胞生生长长所所需需要要，同同时时又又是是细细胞胞代谢的产物，并与维持培养基的代谢的产物，并与维持培养基的pH有关。有关。3 渗透压渗透压：因细胞的类型及种族而异。：因细胞的类型及种族而异。4 无无污污染染及及无无毒毒：无无毒毒是是培培养养细细胞胞的的必必须须条条件件。凡凡与与细细胞胞直直接接或或间间接接接接触触者者，若若具具细细胞胞毒毒性性，都都会会导导致致细细胞胞的的死死亡亡。污污染染问问题题包包括括细细菌菌等等微微生生物物的的污污染染、不不同同细细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染。第11页/共22页肿瘤细胞的培养肿瘤细胞的培养v肿瘤细胞（肿瘤细胞（tumor cell）在组织培养中占有在组织培养中占有核心的位置。首先癌细胞是比较容易培养的细核心的位置。首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中，癌细胞系是最多的。胞，当前建立的细胞系中，癌细胞系是最多的。另外，癌症是对人类威胁最大的疾病，肿瘤细另外，癌症是对人类威胁最大的疾病，肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段，肿瘤细胞培养对阐明生物学极其重要的手段，肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。和解决癌症将起着不可估量的作用。第12页/共22页v取材：取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要。癌性转移淋巴结活胸腹水是好的部位非常重要。癌性转移淋巴结活胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，贮存于立即培养，贮存于4，但不宜超过，但不宜超过24小时。小时。第13页/共22页v培养基培养基v肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的般常用的RPMI1640、DMEM等均可。等均可。v肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。也能生长。v肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因为肿瘤细肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因为肿瘤细胞有自分泌（胞有自分泌（Autocrine）性产生促生长物质之）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。第14页/共22页v生物学鉴定生物学鉴定v主要有：形态学观察，异体动物（以用裸鼠为上）主要有：形态学观察，异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等。电镜观察等。第15页/共22页v人胃癌细胞株人胃癌细胞株SGC7901v呈梭形贴壁生长呈梭形贴壁生长v人白血病人白血病细胞胞K562v悬浮浮细胞，胞，规则，圆形形第16页/共22页细胞培养室细胞培养室 的设备的设备CO2培养箱培养箱：5%CO2，T 36.50.5 电热鼓风干燥箱：烘干和干热消毒电热鼓风干燥箱：烘干和干热消毒（80）冰箱：培养用的溶液，冰箱：培养用的溶液，4、20和和80显微镜：倒置显微镜显微镜：倒置显微镜水纯化装置水纯化装置过滤除菌装置过滤除菌装置细胞冷冻储存器：液氮罐、细胞冷冻储存器：液氮罐、80超低温冰箱超低温冰箱离心机、天平、电动吸液器和加样器离心机、天平、电动吸液器和加样器细胞计数板和电子细胞计数仪细胞计数板和电子细胞计数仪pH计计高压蒸汽消毒装置高压蒸汽消毒装置第17页/共22页培养用品的清洗和消毒灭菌培养用品的清洗和消毒灭菌v玻璃：玻璃：浸泡浸泡刷洗刷洗(洗洁精洗洁精)烘干烘干 铬酸过夜铬酸过夜水冲洗水冲洗20遍，蒸馏水去离子水分别冲洗一遍遍，蒸馏水去离子水分别冲洗一遍烘干烘干v胶塞、瓶盖：胶塞、瓶盖：浸泡浸泡刷洗刷洗(洗洁精洗洁精)烘干烘干蒸馏蒸馏水煮沸水煮沸10 min烘干烘干v消毒灭菌：消毒灭菌：高温湿热灭菌高温湿热灭菌 121，20min第18页/共22页培养用液培养用液va.水水：去离子水，主要用于清洗，配制溶液，培：去离子水，主要用于清洗，配制溶液，培养箱用水。养箱用水。vb.PBS缓冲溶液缓冲溶液：维持渗透压、调节：维持渗透压、调节pH值以及值以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为配制溶液的基础液及用于洗涤组织、细胞等。作为配制溶液的基础液及用于洗涤组织、细胞等。vc.胰酶消化液胰酶消化液：0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶溶溶液，其功能液，其功能主要使细胞间的蛋白质水解，细胞分散主要使细胞间的蛋白质水解，细胞分散第19页/共22页培养基培养基一般由合成培养基，血清，双抗组成一般由合成培养基，血清，双抗组成合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。等。血清血清中含有促细胞成长因子多种复杂成分，支持中含有促细胞成长因子多种复杂成分，支持细胞生长一般需加细胞生长一般需加 10血清。血清质量好坏是血清。血清质量好坏是实验成败的关键。实验成败的关键。抗菌素抗菌素 通常是青霉素和链霉素联合使用，称作双通常是青霉素和链霉素联合使用，称作双抗。抗。第20页/共22页四唑盐（四唑盐（MTT）比色法）比色法四唑盐（四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正量成正比。再用酶标仪测定比。再用酶标仪测定OD值值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。第21页/共22页操作步骤操作步骤v（1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于96孔培养板：孔培养板：4000 6000 细胞细胞/孔，每孔培养基总量孔，每孔培养基总量200微升，微升，37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）v（2）加入）加入20微升孔微升孔MTT溶液，继续培养溶液，继续培养24小时。小时。v（3）吸出孔内培养液后，加入）吸出孔内培养液后，加入DMSO（150微升微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结分钟，使结晶物溶解。晶物溶解。v（4）酶标仪检测各孔）酶标仪检测各孔OD值（检测波长值（检测波长490纳米）。纳米）。记录结果，计算记录结果，计算IC50。第22页/共22页