生物制药工程下游技术.doc

一、 概念
1、 生物制药: 是指利用微生物学、 生物学、 医学、 生物化学等研究结果, 从生物体、 生物组织、 细胞、 体液等, 利用生物技术原理和方法制造一类用于预防、 诊疗和诊疗制品。
2、 基因工程: 是指在体外按既定目和方案, 将一目基因片段, 与载体结合, 组成DNA重组体, 随即引入受体细胞中, 随细胞繁殖而扩增, 同时也可进行基因表示, 产生特定基因产物或新性状遗传物质技术。
3、 载体: 是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表示工具, 载体本质是DNA 。
4、 质粒: 是染色体外能自主复制双链闭环DNA分子。
5、 沉淀: 是溶液中溶质由液相变成固相析出过程。
6、 盐析: 是一个依据蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度低特点来分离蛋白质方法。
7、 等电点沉淀法: 是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而多种蛋白质又含有不相同电点特点进行分离方法。
8、 凝胶过滤层析: 是以多孔性凝胶填料为固定相, 按分子大小次序分离样品中各个组分液相色谱方法。
9、 离子交换层析: 带有不一样电荷物质, 对层析柱中离子交换剂亲和力不一样, 通达改变冲洗液离子强度和pH值, 将物质依次从层析柱中洗脱分离出来方法。
10、 亲和层析: 就是依据生物大分特异性分子识别建立一个纯化方法
11、 膜分离: 在压力、 电场或温差作用下, 一些物质能够透过膜, 而另些物质则被选择性拦截, 从而使溶液中不一样组分, 或混和气体不一样组分被分离,这种分子级分离称为膜分离。
12、 电泳: 在直流电场中, 带电粒子向带符号相反电极移动现象称为电泳。
13、 分光光度技术: 利用紫外光、 可见光、 红外光和激光等测定物质吸收光谱, 利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析方法
二、 简答题
1、 现代生物制药下游技术包含哪些内容
1.生物反应器及大规模细胞培养 2.生物细胞破碎技术 3.生物分子分离纯化技术
4.生物分子含量检测技术 5.生物分子判定技术 6.生物分子活性检测技术
2、 基因工程基础操作过程
包含目基因制备、 基因载体选择、 DNA重组、 DNA重组体转化、 重组体筛选和判定、 外源基因表示
3、 生物化学样品制备特点
⑴生物材料组成极其复杂, 常常包含有数百种乃至几千种化合物。
⑵很多生物大分子在生物材料中含量极微, 分离纯化步骤繁多, 步骤长。
⑶很多生物大分子一旦离开了生物体内环境时就极易失活, 所以分离过程中怎样预防其失活就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子制备几乎都是在溶液中进行, 温度、 pH值、 离子强度等多种参数对溶液中多种组成综合影响, 极难正确估量和判定。
⑸为保护所提取物质生理活性及结构上完整性, 生化分离方法多采取温和“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至多个多至几十个步骤, 并不停变换多种分离方法, 才能达成纯化目
4、 生化分离制备试验设计基础思绪
⑴确定要制备生物大分子目和要求, 是进行科研、 开发还是要发觉新物质。
⑵建立对应可靠分析测定方法, 这是制备生物大分子关键。
⑶经过文件调研和预备性试验, 掌握生物大分子目产物物理化学性质。
⑷生物材料破碎和预处理。
⑸分离纯化方案选择和探索, 这是最困难过程。
⑹生物大分子制备物均一性（即纯度）判定, 要求达成一维电泳一条带, 二维电泳一个点, 或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
⑺产物浓缩, 干燥和保留。
5、 蛋白质盐析原理及优缺点
原理: 蛋白质是由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成, 在水中蛋白质折叠后, 由亲水性氨基酸与周围水分子形成水化膜, 所以, 蛋白质在水溶液中溶解度是由它周围亲水基团与水形成水化膜程度, 以及蛋白质分子带有电荷情况决定。当用中性盐加入蛋白质溶液, 盐对水分子亲和力大于蛋白质, 致使蛋白质分子周围水化膜层减弱乃至消失。同时, 在蛋白质溶液中加入盐后, 因为离子强度发生改变, 蛋白质表面电荷大量被中和, 愈加造成蛋白溶解度降低, 使蛋白质分子之间聚集而沉淀, 实际上是一个去水化过程。
优点: 操作简单 成本低廉 适用范围广 环境温和不易造成蛋白质失活
缺点: 分辨能力差 .纯化倍数低 沉淀中含盐分较多
6、 离心操作时应注意哪些事项
1、 首先应依据试验需求选择适宜转子和转速, 不要超出转子和离心机限定最高转速。
2、 使用多种类型离心机都应该在托盘天平上正确配平, 平衡时重量之差不得超出各个离心机说明书上所要求范围, 配平后对称放置在转子中。
3、 装载溶液时, 要依据转速和液体性质选择适宜离心管, 确保离心管能承受住, 仔细观察离心管有没有裂痕或沙眼, 以免离心时液体渗出; 如液体进入转子造成离心机腔内污染, 应立刻将之取出, 擦拭洁净。
4、 若要在低于室温温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机转头室内预冷。
5、 开启离心程序后要等离心机达成预设转速平稳运行后才能离开离心机; 如有异常声音应立刻停机检验, 立刻排除故障。
7、 举出4种以上细胞破碎方法及其特点
高压匀浆法: 可达较高破碎率, 可大规模操作, 不适合丝状菌和革兰氏阳性菌
高速珠磨法: 可达较高破碎率, 可较大规模操作, 大分子目产物易失活, 浆液分离困难
喷雾撞击破碎: 细胞破碎仅发生在与撞击板撞击一瞬间, 细胞破碎程度均匀, 可避免细胞反复受力发生过分破碎现象。细胞破碎程度可经过无级调整载气压力（流速）控制, 避免细胞内部结构破坏, 适适用于细胞器回收。
超声破碎: 对酵母菌效果较差, 破碎过程升温猛烈, 不适合大规模操作
化学渗透: 优点（与机械法相比）:对产物释出含有一定选择性; 细胞外形保持完整,碎片少,有利于后分离; 核酸释出量少,浆液黏度低,便于深入提取。
缺点: 时间长,效率低; 化学试剂去除困难且含有毒性; 通用性差。
酶溶法: 利用酶反应, 分解破坏细胞壁上特殊键, 从而达成破壁目。优点: 专一性强, 发生酶解条件温和, 缺点:酶水解费用较贵, 通常只适适用于小规模试验室研究。
渗透压冲击法: 破碎率较低, 常与其她方法结合使用
冻结- 融化法: 将细胞放在低温下忽然冷冻和室温下融化, 反复数次而达成破壁作用。对于细胞壁较脆弱菌体, 可采取此法。但通常破碎率很低即使反复循环数次也不能提升收率。另外, 还可能引发对冻融敏感一些蛋白质变性。

8、 凝胶过滤层析原理
凝胶是由胶体溶液凝结而成固体物质, 内部含有网状筛孔, 利用球状凝胶内筛孔, 使分子流过填充凝胶管柱时, 大分子无法进入凝胶筛孔, 而只流经凝胶及管柱间孔隙, 很快就能够流出管柱, 较小分子因为进入凝胶内筛孔, 故在管柱内停留时间较长, 由此区分大小不一样分子, 亦可与已知大小分子作比较而确定物质分子量。通常情况下, 凝胶不会吸附成份, 全部欲分离物质都会被洗出, 这是凝胶层析法与其它层析法不一样地方。

9、 离子交换层析原理, 举例说明
原理:是以离子交换剂为固定相, 依据流动相中组分离子与交换剂上平衡离子进行可逆交换时结协力大小差异而进行分离一个层析方法。
离子交换层析纯化血清蛋白质
血清中白蛋白、 α-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白（血清白蛋白等电点为pH4.9, α及β球蛋白等电点都小于6、 γ-球蛋白pl约为7.3）
10、 控制膜污染注意事项
1、 膜材料选择: 膜亲疏水性、 电荷性会影响到膜与溶质间相互作用大小, 亲水性膜和膜材料电荷与溶质电荷相同膜较耐污染。
2、 膜孔径或载留分子量选择: 待分离物质尺寸大小与膜孔相近时, 极易产生堵塞作用。
3、 膜结构选择: 选择不对称孔径中空纤维超滤膜, 用反洗可处理堵塞问题。
4、 溶液pH控制: 调pH值远离被分离蛋白质等电点。
5、 溶液中盐浓度影响: 无机盐直接对膜影响, 无机盐影响蛋白质溶解性。
6、 溶液温度影响: 温度升高有时有利于超滤, 有时不利于超滤。
7、 溶质浓度, 料液流速与压力控制
11、 电泳关键类型及作用
自由电泳法: 是指在溶液中进行电泳, 不用支持物。在移动界面电泳中, 混合物不一样组成成份显示在相对应运动区域内, 而这些运动区域是一个一个部分地重合着。该法能够确定带电物质迁移率, 而且能用来研究混合物组成成份, 不过它不能用来分离混合物, 也不适适用于研究低分子量物质, 关键用于蛋白质系统等生物大分子研究方面。
区带电泳: 是指有支持介质电泳, 待分离物质在支持介质上分离成若干区带。

12、 画制电泳图谱

13、 分光光度法测定蛋白质方法
Lowry法: 是将双缩脲试剂和Ｆolin试剂即磷钼酸—磷钨酸试剂一并加入到蛋白溶液中, 蛋白质发生两步反应: 一是肽键与碱性硫酸铜发生双缩脲反应; 一是蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基与Ｆolin试剂也发生颜色反应, 两个反应结果使反应液颜色更深（深蓝色)。反应产物在660nm处测定光密度值, 然后在标准曲线图上即查得所测样品中蛋白质浓度。
紫外吸收法: 蛋白质分子中酪氨酸、 色氨酸含有共轭双键, 在280nm处对紫外光含有最大吸收值, 且在一定程度上,吸收程度与浓度成正比,利用这一性质, 可测定蛋白质浓度 。试验中, 核酸在紫外区也有很强吸收能力, 可经过校正加以消除。
（一） 280nm直接检测法: 直接测定标准蛋白质溶液和未知蛋白质溶液在波长280nm处光密度, 然后应用下列公式进行计算得出未知蛋白质溶液浓度。

（二）标准曲线法
（三）280nm和260nm吸收差法: 因为核酸在280nm处也有吸收, 从而会干扰蛋白质测定, 同时测定280nm和260nm光密度值, 然后算出蛋白质浓度。
1.45×OD280nm-0.74×OD260nm=蛋白质浓度（mg/mL）
Bradford检测法: 是蛋白质与考马斯亮兰（G-250）结合反应, 产生红色至蓝色有色化合物, 当G-250单独存在时为红色, 当其与蛋白质结合后, 其颜色变为蓝色。所形成复合物在595nm处有特异吸收, 所以, 可检测595nm光吸收值大小计算蛋白含量。