已冻存细胞的传代培养.docx

已冻存细胞的传代培养
实验试剂
细胞培养液成分为RPMI1640基本培养液 10%胎牛血清 1%三抗，PBS，冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，Trypsine-EDTA消化液，液氮
实验设备
水浴锅，35mm培养皿，37℃培养箱，无菌冻存管，低温冰箱，超低温冰箱
实验材料
已冻存的HEK293和HeLa细胞
实验步骤
1. 细胞的复苏
    1) 保存细胞的冷冻管直接投入37℃温水，不时摇动令其尽快融化，解冻1分钟；
    2) 取出冷冻管，用酒精消毒后打开管盖，吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再用培养液重复洗一次；
    3) 用培养液适当稀释后，接种35mm培养皿中，反复吹打混匀后，放在37℃的培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。
2. 细胞的传代(贴壁细胞的消化法)
    1) 吸出皿内旧的培养基，加PBS于皿中，清洗两次，用于洗去瓶内残存的血清，以防止血清对胰蛋白酶活性的影响；
    2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液轻轻摇动，使消化液流遍所有细胞表面充分消化细胞，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立刻终止消化；
    3) 吸出消化液，再加培养液，反复吹打至没有细胞团。吹打动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫，这些都会对细胞有损伤。将细胞悬液接种到新的培养皿中。
3. 细胞的冻存
    1) 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，最好是对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。冻存前一天换一次培养液；
    2) 用Trypsin-EDTA把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数离心；
    3) 去除Trypsin-EDTA，加入配制好的冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，冻存液中细胞的最终密度为106/ml-107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管，每个冻存管加液1-1.5ml。冻存管上标明细胞的名称；
4) 把冻存管放入4℃冰箱30min；然后转移至-20℃2h；随后将冻存管转移到-80℃过夜；第二天迅速浸入液氮中长期保存。要适当掌握降温速度，过快会影响细胞内水分的渗出，太慢则促进冰晶的形成。

传代细胞培养与观察
实验原理
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的 水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
实验试剂
L磷酸盐缓冲液(PBS)
无钙、镁溶液
细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
0.5％台盘蓝染液等
实验设备
解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
实验材料
喉癌细胞
实验步骤
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1. 营养液配制:
EMEM液                                90%
犊牛血清                                10%
双抗(1万单位／m1)                加至约100单位／m1
3％谷氛酞胺                           1m1
7.4％NaHCO3                         调pH至6.8—7.0
2. 换液:
在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。
3. 消化与分装
在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加 0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留1—2min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝 隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培 养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之进行分装。
4. 培养
分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37℃培养。
5. 观察
   1) 观察体外培养细胞的几个问题；
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
      a. 首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度
      b. 观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。
      c. 如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照2)的描述进行。
      d. 观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
   2) 细胞的生长阶段及其形态特征
传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：
      a. 游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。
      b. 吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。
      c. 繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群， 常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少， 细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：
十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25％以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。
十十：细胞占瓶壁有效面积的25—75％以内具新生细胞。
十十十：细胞占瓶壁有效面积的75—95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十：细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。
从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。
      d. 维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增 多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
      e. 衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞 经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。