酵母菌RNA的提取.doc

实验十、酵母RNA的提取及鉴定
v 一.目的
掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
v 二、原理
v 酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。
v RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。
v 三、实验仪器
• 离心机
• 水浴锅
• 电炉
• 烧杯
• 量筒
四、实验试剂
• 干酵母粉
• 0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
• 乙酸
• 95%乙醇
• 无水乙醚
• 10%硫酸
• 氨水
• 5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。
五、实验步骤
v 1.RNA的提取：称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。
v 取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。
v 滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。
v 洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。
v 2.鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。
v 水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物,有时沉淀出现比较慢,需要静止10几分钟。
v 注意事项：离心的时候，要两两对称放置，且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。
六．实验结果

七．实验分析
实验所得RNA不够理想，可能在提取中受到了污染。
原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA, 信使RNA(mRNA),核糖体RNA (rRNA),转运RNA(tRNA).而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息. 由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要.
提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤
RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA),也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,
处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.
方案:
1)工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.
2)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.
3)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.
4)分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 ℃ 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.
从组织中提取RNA则要注意:
动物器官的解剖器械,存放组织块的玻璃器皿,冻存组织块所用的器皿,组织器官的冲洗液,人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染。一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.