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作物转基因育种研究进展

摘要：近年来，植物基因工程取得了辉煌的成就，而转基因技术由于其巨大的产业价值,特别是在作物品质改良、产量和抗逆性提高等方面的明显优势,一直是国际农业高新技术竞争的焦点和热点。本文主以棉花、玉米、水稻为例就转基因育种技术在作物上的研究进展进行相关的介绍。
关键词：作物，棉花，玉米，水稻，转基因育种，研究进展
植物转基因技术是指利用重组技术、细胞DNA培养技术或种质系统转化技术将目的基因导入植物基因组，并能在后代中稳定遗传，同时赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。常规育种常常受有性杂交亲和性的制约，而利用转基因技术可以打破物种界限、克服有性杂交障碍，快速有效地创造遗传变异，培育新品种、创造新类型，大大缩短新品种育成的时间。因此，随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术也蓬勃发展［1］。
1 转基因棉花育种的研究与进展
近年来，随着基因工程技术的不断发展，利用生物技术来创新棉花种质资源和培育新品种是一条非常有效的途径，极大地推动了棉花遗传育种的发展［2］。中棉所是世界上唯一可以同时采用农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪轰击法快速获得转基因抗虫棉新材料的技术平台,能将植物嫁接技术成功应用于转基因棉花的快速移栽,成活率超过90%。未来3~5年,中棉所将挖掘、整合与优化抗病、抗除草剂等基因10个,筛选高产因子、高品质纤维等基因或分子标记150个,创造转基因棉花育种新材料100份以上,培育重大新品种(组合)3~5个。
1.1转抗虫基因
1991年成功将外源Bt基因导人棉株中，1992年人工合成了全长1824bp的CrylAb和CrylAc融合的GFMCry1A基因，并于1993年采用农杆菌介导法和外源基因胚珠直接注射法成功导入晋棉7号、中棉12、泗棉3号等主栽品种，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花株系；包含CryIAc和AP基因双价抗虫基因载体，通过农杆菌介导转化冀合321胚性愈伤组织，经6代筛选后培育出抗棉铃虫90%的纯合品系，且农艺性状均优于对照。
1.2转抗黄萎病相关基因
利用花粉管通道法和农杆菌介导转化法将菜豆中的几丁质酶和烟草中的葡聚糖酶基因转入棉花，并从转基因高世代材料中筛选出了高抗黄萎病的品系；将天麻抗真菌蛋白基因用花粉管通道法转化天然彩色棉主栽品种，从高世代系中选育出既抗枯萎病又抗黄萎病的兼抗材料；将葡萄糖氧化酶基因(GO)转入棉花，转基因后代对枯萎病和黄萎病抗性均有显著提高，部分材料抗性达到抗病水平。
1.3转抗除草剂基因
1997年由美国孟山都公司推出抗除草剂棉花抗性品种，他们从土壤农杆菌变种CP4中分离到编码抗草甘膦酶的基因，并通过农杆菌介导法转化珂字棉312，把该基因导入棉花植株，从而使其对草甘膦产生抗性。采用中棉35下胚轴为材料，将草甘膦突变基因aroAM12导入到棉花中，获得65棵再生植株，通过Southern及Western试验验证了该基因的导入和表达状况，结果表明，转化株对草甘膦具有很高的抗性；将抗草甘膦基因aroAM12和抗虫基因Btslm一起整合到一个载体中，并以抗草甘膦基因作为选择标记，通过转化棉花品种石远321后获得了抗草甘膦和抗棉铃虫的再生株。
1.4转基因棉花品质性状改良的研究
转基因杂交抗虫棉邯棉646的选育［3］获得成功，培育出了丰产、优质和抗逆性较强的棉花；通过花粉管通道转基因技术，将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导入高产棉花品种“苏棉16号”，对阳性植株通过PCR检测，最终确定3株结果稳定的转兔角蛋白基因棉株。经品质分析，这3个株系成熟棉纤维的品质部分得到改良，尤其比强度有较大幅度提高，与转基因受体相比平均提高6.3cN/tex。利用基因工程技术，调节棉纤维的发育进程，如纤维伸长的速率或持续的时间，或者改变棉纤维的化学组成，以改变棉纤维的理化性质，最终实现改良棉纤维的目的，这已经成为新世纪棉花创新研究的新领域。
2 转基因技术在玉米育种上的研究与进展
转基因技术将玉米基因库中不具有的抗性基因导入玉米，实现了传统育种方法无法实现的基因重组，大大提高了育种水平。转基因玉米的研究从20世纪80年代中期开始到现在的短短十几年时间已经利用转基因的途径将大量的转基因导入玉米，培育出了一批抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐、抗旱、优质等多种优良玉米品种或新种质［4］。分子标记技术、转基因技术等基因工程被广泛地应用于玉米分子图谱构建、玉米优势群划分、基因定位、基因克隆等方面。基因工程集现代新技术如细胞培养技术、分子杂交技术、转基因技术、分子标记技术和基因表达技术等为一体，使育种技术进入了一个高新技术的时代［5］。
2.1玉米转基因技术
应用转基因技术将目的基因导入合适受体并获得稳定的转基因植株是转基因的重要环节。转基因技术的不断发展和完善使得转基因工作得以迅速开展，目前玉米已开拓建立了多种转基因技术，分别适应于不同的受体。
2.1.1 DNA直接转入技术
基因枪法：基因枪法也是转基因技术中经常使用的方法，该技术主要借助高速运动的金属微粒将附着在其表面的核酸分子引入到受体，1987年由美国康奈尔大学的Sanford等人发明并很快用于玉米基因转化研究。1994年，赵天永等用基因枪将GUS基因导入玉米茎尖组织；1995年王国英等用基因枪法将防御素基因转入玉米并再生植株；原亚萍以玉米愈伤组织为受体，用基因枪轰击将防御素基因装入玉米细胞，经卡那霉素筛选及分化培养获得一再生植株。1999年，中国农业科学院董云洲等用基因枪法转化花粉获得了转基因谷子和玉米，所用基因为GUS。基因枪法是玉米基因转化常用的方法，也是效果最好的方法。基因枪法无宿主限制，靶体类型广泛，操作简便，但其转化频率低，插入位点和拷贝数不稳定。
PEG法：PEG是细胞融合剂，能促进细胞膜间融合，利于外源DNA进入原生质体。这种方法成本低，结果比较稳定，存在的问题是建立可靠高效的原生质体再生系统比较困难。
电击法：电击法是利用高压电脉冲对细胞“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的摄取。电击法可以用于原生质体，还可以用于胚性悬浮细胞系、愈伤组织和幼胚等，操作比较简单，但转化效率低，插入位点和拷贝数不稳定。Frommm等人于1986年首次用电击法转化玉米原生质体，获得了转化愈伤组织成功后，Rhodes等人于1988年又成功地用电击法获得了转基因玉米植株。
超声波介导法：原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。超声波介导法转化效率较高，但操作繁琐，载体DNA在处理时易断裂。
2.1.2载体转化技术
目前，已有百余种转基因植物问世，众多转基因植物中的80%是由农杆菌介导转化的。Crismly(1987年)将玉米条锈病毒的cDNA导入玉米，使植株表现了系统的感染症状，第一次证实农杆菌能够侵染玉米。农杆菌介导法具有能转移较大的DNA片段、整合的外源基因重排少且多以单或寡拷贝整合等优点。但是，由于玉米是单子叶植物，不是农杆菌的天然宿主，所以转化率低，这使农杆菌介导法在玉米上的应用受到限制。
2.1.3种质转化技术
种质转化技术指外源DNA借助生物自身的种质系统或细胞结构功能实现的转化，进展比较大的是花粉管通道法和子房注射法。
花粉管通道法：玉米为穗状花序，小花丛生，具有发达的有性繁殖系统，每穗结实粒多，花粉易于采集，体外存活时间长，花粉管通道法介导基因转化具有便利的条件。基本原理是授粉后外源DNA沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化为尚不具备正常细胞壁的细胞、合子或早期胚胎细胞。
子房注射法： 1993年，北京农业大学丁群星等用子房注射法将Bt毒蛋白导入玉米自交系，培育出一株转基因玉米。1995年，祈永红等陆续报道了利用花粉管通道等技术成功地将外源总DNA导入玉米自交系，获得了具有广泛变异的不同类型的自交系，包括与玉米品质有关的氨基酸含量的变化等。2002年，王罡等将Bt基因通过花粉管通道法导入吉林省骨干玉米自交系，现正在研究将抗旱、耐盐基因导入玉米自交系。
2．2玉米转基因育种的分类
2.2.1抗虫性育种
虫害是制约玉米生产的一大因素。现已分离到上万个Bt菌种。根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成七大类，又根据结构基因中的限制性酶切图谱和他们之间的同源性分成了29个亚类。抗虫转基因玉米主要应用的是Bt毒蛋白基因。美国孟山都公司等改造合成了多种Bt杀虫蛋白基因，并转入玉米。目前，我国的转基因玉米已开始环境释放试验。
2.2.2抗病性育种
抗病转基因玉米的主要目标是抗病毒和抗真菌病害。研究发现玉米矮花叶病毒(MDMV)B株外壳蛋白在转基因植株中表现出对MDMV的抗性。另外，转几丁质酶基因玉米被认为具有抗真菌病害的效果。
2.2.3抗除草剂育种
把自然选出的对除草剂有抗性的基因整合到玉米的基因组，培育出抗性新品种，这是控制杂草的一种高效、低成本、无公害手段。1986年，Fromm等将抗除草剂pat基因转入了玉米原生质体中，目前已经培育出了抗草甘磷、草铵磷、咪唑啉酮、稀禾定等抗除草剂转基因玉米，经过除草剂抗性稳定性以及大田生产的试验，效果良好，并且已经进入商业化生产阶段。
2.2.4高品质育种
玉米的品质相对较差，蛋白质、赖氨酸的含量较低，其中赖氨酸的含量只占种子干重的0.27%左右，不论是作为粮食还是作为饲料，都不能满足高品质的要求。因粗赖氨酸是玉米蛋白质中的限制性氨基酸，含量高低直接关系到玉米的营养价值。Hoods等报道了通过转基因玉米生产鸡蛋抗生素蛋白，并已进入商业化生产。
2．2．5远缘杂交育种
通过转基因技术可以将两个甚至多个本来不可能形成配子的物种重新组装成一个新的物种，在一定的环境中使其表现出特定的表形，符合人类的需求。
2.2.6不育系基因工程
Plant Genetic Sys-tems N.V(PGS)公司分离并表达了能阻止花粉的产生以形成雄性不育植株的基因，用电激法导入未成熟玉米胚，外源基因及其启动子可破坏玉米花药细胞的mR-NA。1992年用该法获得不育系植株，导入基因稳定性已连续保持三代以上。
2.3玉米转基因育种的应用前景
在分子生物学飞速发展的今天，分子标记技术在玉米育种中发挥越来越大的作用。可以预料，在不久的将来，玉米的很多重要的性状如抗虫、抗病、抗旱、高油、高淀粉等性状都能像玉米QPM育种一样，通过某个紧密连锁的标记来进行选择，大大缩短玉米品种的育种年限。
3 转基因与水稻育种
3．1水稻的遗传转化
3.1.1多基因转化
在作物中,有许多性状是由多个基因控制的。为了改良这些性状,就需要把多个基因同时转入同一种作物中去。此外,为了快速聚合多个质量性状或将由多个基因控制的新代谢途径引入到转基因作物中去,都需要采用多基因转化的方法。比较著名一个多基因转化的例子就是金色稻米(golden rice),它是通过转入两个新的基因而在水稻的胚乳中建立了β-胡萝卜素的合成途径。
3.1.2组织特异性/诱导性表达
组织特异性或诱导性地表达外源基因对于转基因育种也是至关重要的。组织特异性或诱导性表达一般需要通过使用特异性的启动子来实现。采用根癌农杆菌介导将绿色组织特异性表达的rbcS基因启动子驱动下的cry1C*基因导入粳稻品种中花11,获得了高效抗虫且Bt蛋白仅在绿色组织中高效表达的转基因株系。
3.1.3叶绿体转化技术
外源基因的两侧带有叶绿体基因组的同源序列,可以通过同源重组的方式整合到叶绿体的基因组中。
3.1.4水稻耐盐相关基因的遗传转化
国内外学者已经克隆了一些耐盐相关基因,并通过转化相关耐盐基因,获得了一些耐盐性提高的转基因植物,展示了诱人的前景［6］。
3.2转基因抗虫水稻
迄今为止,人们在植物、动物甚至微生物中已鉴定并克隆了许多有用的抗虫基因。目前，应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因（Bt基因）、昆虫蛋白酶抑制剂（Pi基因）和植物凝集素基因3种［7］。
3.3转基因抗病水稻
包括抗细菌性病害白叶枯病以及抗真菌性病害稻瘟病和抗纹枯病的研究，此外近年来对数量抗性基因(抗病QTL)的研究也值得注意。 有些水稻病害如水稻纹枯病、稻曲病和细菌性条斑病,还未在水稻中发现抵抗这些病害的主效基因,抗病QTL的研究对于培育抵抗这些病害的品种是非常重要的。
3.4转基因抗旱水稻
目前转基因技术已被广泛应用于抗旱水稻的培育,通常所采用的策略就是在转基因水稻中表达干旱诱导或抗旱相关基因。
3.5转基因营养高效利用水稻
包括氮的高效利用和磷的高效利用。一些研究者尝试通过过量表达某些氨基酸转氨酶来改变植物体内氨基酸合成和氮代谢的水平，以期望增强转基因水稻中氮利用的效率。
3.6转基因优质水稻
在转基因优质水稻研究上,利用转基因技术改良稻米营养品质的研究相对较多,如高蛋白含量转基因水稻的研究。
3.7转基因高产水稻
转基因高产水稻的培育主要是集中于C4水稻的研究上。长期以来,许多植物学家和育种家都希望可以将C3作物改良为C4作物,而转基因技术的兴起也为C3作物改良为C4作物带来了希望。
3.8转基因抗除草剂水稻
发展转基因抗除草剂作物通常采用两个策略:(1)修饰除草剂作用的靶蛋白基因,通过降低靶蛋白的敏感性或提高其表达水平来获得对除草剂的抗性；(2)通过转基因技术引入新的酶系统来提高植物对除草剂的代谢能力从而达到抗除草剂的效果［8］。
4 国内外转基因育种的发展状况
我国在转基因植物研究方面，总体上已接近国际水平，在发展中国家处于领先地位。我国转基因作物的种植面积位居第4，为210万公顷，占全球转基因作物种植面积的4%。近年在农作物抗性生物技术育种方面已取得重大突破，现已获得抗虫棉花、抗病毒水稻、抗青枯病马铃薯，以及分别具有抗赤霉病、白粉病及黄矮病小麦等具有某种抗性的大田作物。基因工程育种技术已经在农业生产中显示出巨大的活力。自第1例转基因作物诞生以来，随着转基因技术的发展，单纯的抗虫、抗病等转基因作物越来越难以满足人们的需要，于是各种拥有多种营养，甚至直接用来治疗疾病的转基因作物被科学家们研究制造出来。2007年5月，美国农业部批准了一种能够表达人类乳汁中常见蛋白的转基因水稻，开始大规模种植。这种由美国加州的文特里亚生物科学公司研发的转基因水稻产出的大米含有人类乳汁中常见的溶菌酶、乳铁蛋白以及人类血清蛋白，其中，前两者具有抗菌作用。将该转基因大米制成饮品，可以治疗肠胃感染引起的腹泻、脱水等疾病，并用作贫血等症状的饮食补充。这种稻米的出现是转基因食品发展的重要一步，它将源于人类的基因与植物相混合，被称作“弗兰肯斯坦食品”。在英国，布里斯托尔大学的科学家从海藻和蘑菇中分离出负责制造不饱和脂肪酸的3个基因，并植入水芹。实验证明，食用这种水芹，能够调节人体血压和免疫反应。还具有明显促进大脑发育、降低成年人心脏病及风湿性关节炎的发病率等功效。从而使这种水芹成为一种“超级保健”蔬菜。这种转基因水芹可以直接食用，也可以通过饲喂动物进入食物链后再供人食用。这一成果是功能性食品研究的又一大进展［9］。
5 转基因育种存在的问题及措施
通过转基因技术生产的产品具有抗性强、产量高、品质好及商品经济效益高等优点,但也存在安全性问题。目前,转基因植物的安全性问题主要有两方面:一方面是环境安全性,另一方面是食品安全性。在环境安全性方面主要是:一是基因漂移,二是对生物多样性的影响。在食品安全性方面,转基因产品可能对人类健康的危害主要有:一是可能含有已知或未知的毒素,引起人类急、慢性中毒或有致癌、致畸、致突变的作用;二是可能含有已知或未知的免疫或致敏物质,引起机体产生变态反应或过敏性反应;三是转基因产品中的主要营养成分、微量营养成分及抗营养因子可能产生变化,会降低食品的营养价值,营养结构失衡,使人体出现某种病症等。尽管转基因技术在应用上存在安全性问题,但值得肯定的是,它是一项非常有用的生物技术,在作物育种方面有着非常广阔的应用前景,会对人类未来产生深远的影响［10］。
总之，作物育种的转基因技术主要有农杆菌介导法、基因枪法、电击、聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法等。培育的主要是抗病毒、抗细菌和真菌、抗虫、抗除草剂等的作物。转基因育种已经取得了很大的发展，相信在未来，转基因育种的前景将会越来越光明，在农业上的贡献越来越大。

参考文献：
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