在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第1页,汇报提要,调控网络概述,调控网络分类,调控网络研究方法,在基因水平上探索基因表示代谢和遗传控制,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第2页,调控网络概述,在生物机体内，全部生命活动过程都受到严格调整控制，以最有效地方式和路径适应内外环境改变，以有利生物机体生存繁衍，这些调整控制能够从不一样层次水平，经过不一样路径和方式，以不一样机制进行调控，而且，不一样调整路径和方式彼此之间能够发生有机联络，相互作用、相互影响，协调一致，从而组成了复杂调控网络。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第3页,调控网络分类,可依据不一样功效分类：,神经调控网络,免疫调控网络,代谢调控网络,激素调控网络,细胞内信号传导调控网络,基因表示水平调控网络,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第4页,调控网络研究方法,组织及细胞学方法,基因突变技术,突变体筛选,基因工程技术,基因缺失,基因过表示,转基因技术,生物芯片技术,基因芯片,蛋白质芯片,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第5页,在基因水平上探索基因表示代谢和遗传控制,Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale,Joseph L.DeRisi,Vishwanath R.Iyer,Patrick O.Brown,Science Vol.278.24 Oct.1997:680686,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第6页,当前，,10,各种微生物基因组全序列已测定。在以后几年中，将有望知道几个多细胞生物基因组全序列，其中包含人类基因组序列。然而，在这些基因组中，明确每一个基因功效和作用将是一项十分艰巨任务，而且从整体水平上了解基因组在生物机体复杂生命历程中怎样发生作用，对于咱们将更是一个严峻挑战。,知道一个基因何时何地被表示经常为其生物学作用提供了强有力线索。相反，在一个细胞中，不一样基因表示模式能够为细胞所处状态提供详细信息。尽管蛋白质丰度调整在一个细胞中绝不单独经过,mRNA,调控来完成，但实际上细胞类型或状态全部差异则与许多基因,mRNA,水平改变相关。这是偶然，因为对特定基因测定其,mRNA,含量则需要一特效试剂，即是其,cDNA,序列。,DNA,微阵列技术（基因芯片），是将数千个单个基因序列高密度排列在一张显微镜载玻片上，这种技术为在大规模研究基因表示提供了一个实用经济工具。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第7页,酿酒酵母是一个进行基因表示系统观察研究尤其好研究材料。这些基因在基因组序列中轻易识别，顺式调控元件通常紧凑并靠近转录单元，相关它遗传调控机制已经了解很多，而且一套有力工具可用于它分析。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第8页,酵母糖代谢普通特点,酵母自然生长史中一个重复,循环包含了从厌氧（发酵作用）到需氧（呼吸作用）代谢转换,。,将酵母接种到富含糖基质中会引发由发酵提供能量快速生长，产生乙醇。,当可发酵糖用尽时，酵母细胞转向将乙醇作为碳源供有氧生长。,这个基于葡萄糖损耗从厌氧生长到需氧呼吸转换，即指如,双峰转换,（,Diauxic shift,）,.,该转换与包括到细胞基础代谢过程中基因表示中普遍改变相关，这些代谢包含碳代谢、蛋白质合成，和碳水化合物储存等。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第9页,Fig.3.,Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression.,酵母中代谢路径,糖酵解,有氧呼吸,TCA,循环,乙醛酸循环,糖异生,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第10页,咱们使用,DNA,微阵列来刻画整个基因组基因表示过程改变，并研究调控和执行该过程遗传路径,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第11页,基因芯片技术研究糖代谢中基因表示调控普通过程,DNA,微阵列制备,6400,个,DNA,序列,提取制备,RNA,探针,制备荧光标识,cDNA,杂交,酵母细胞,反转录,指数生长细胞不一样培养阶段,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第12页,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第13页,图讲解明,DNA,微阵列制备：,利用购置一组引物对,将酵母开放阅读框个别经过,PCR,放大,.,，包含大约,6400,个清楚,DNA,序列，被用一个简单自动机械印刷装置印刻在玻璃载片上,组成对应,DNA,微阵列。,mRNA,探针制备：,未来自以指数生长培养酵母细胞接种到新鲜基质中在,30C,生长,21,小时。在开始生长,9,小时后，然后依次取得经历间隔,2,小时,7,个不一样阶段连续培养样品，并分离制备,mRNA,。,cDNA,制备：,经过,Cy3(,绿色,),或,Cy5(,红色,)-,标识,dUTP,经反转录制备荧光标识,cDNA,，,杂交：,cDNA,与微阵列杂交。,观察、分析,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第14页,图讲解明,为使识别基因表示水平改变可靠性最大化，咱们标识了从每个连续间隔时间点培养细胞中取得,cDNA,用,Cy5,标识,，,然后将其与,Cy3-,标识,对照,cDNA,样品混合,，后者来自于从接种后第一个间隔时间得到细胞。,在这个试验设计中，测量每一个排列单元,Cy3,和,Cy5,荧光物质相对荧光强度，能够提供为两个细胞群体中对应,mRNA,相对丰度一个可靠量度,(Fig.,1,),。,来自,7,个样品系列数据（见,Fig.2,）,由超出,43000,表示率量度单位组成，被组织成一个数据库,以推进对试验结果深入探索和高效分析。该数据库可在网上公开取得。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第15页,Fig.1.,Yeast genome microarray,在这个试验设计中，测量每一个排列单元,Cy3,和,Cy5,荧光物质相对荧光强度，能够提供为两个细胞群体中对应,mRNA,相对丰度一个可靠量度,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第16页,Fig.2.,The section of the array indicated by the gray box in Fig.,1,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第17页,在一个细胞中，不一样基因表示模式能够为细胞所处状态提供详细信息。尽管蛋白质丰度调整在一个细胞中绝不单独经过,mRNA,调控来完成，但实际上细胞类型或状态全部差异则与许多基因,mRNA,水平改变相关。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第18页,hybridization of the,Cy3-dUTP-labeled cDNA,hybridization,of Cy5-dUTP-labeled cDNA,Genes expressed at roughly equal levels before,and after the diauxic shift,Fig 1.,Yeast genome microarray,TDH1,催化,PEP,GA-3-P,PDC1,催化丙酮酸,乙醛,ALD2,乙醛酸脱氢酶,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第19页,Fig.1,图讲解明,荧光标识,cDNA,探针是来自于从接种后很快细胞中分离得到,mRNA,（培养密度,5106 cells/ml,，基质葡萄糖水平为,19g/liter,）,在,Cy3-dUTP,存在下经过反转录制备。,类似，另一个探针来自培养,9.5,小时后分离同一细胞群中,mRNA,（培养密度,2108 cells/ml,，基质葡萄糖水平为,0.2 g/liter,）,在,Cy5-dUTP,存在下经过反转录制备。,在这幅图中，,Cy3-dUTP-labeled cDNA,杂交（即，,mRNA,在初始时间点表示）显示为绿色信号,，,Cy5-dUTP-labeled cDNA,杂交（即，,mRNA,在,9.5,小时表示）显示为红色信号,。,这么，双峰转换后被诱导或抑制基因在本图中就分别显示为红色和绿色斑点。,双峰转换前后表示水平大致相等基因在本图中显示为黄色斑点,。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第20页,在用于分析双峰转换期间基因表示每个微阵列中,红点代表被诱导与初始时刻相关基因，,绿点代表被抑制与初始时刻相关基因,。,在用于分析,tup1,突变和,YAP1,过表示影响阵列中,红点代表表示增加基因，,绿点代表经遗传修饰造成表示降低基因。,注意区分显著基因组是在不一样试验中被诱导和抑制。,在,600nm,光密度下测量细胞密度是用于测量培养物生长情况。,Fig.2.Fig.,1,中灰色方框标识个别阵列所显示所描述每组试验,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第21页,Fig.2.,图讲解明,酵母在,Glu,培养基上进行指数生长过程中，,其基因表示整体情况是相当稳定。,在比较最初两个细胞样品基因表示情况时（间隔,2,小时收获），,19,个基因,(0.3%),mRNA,水平差异,2,倍或,2,倍多，最大差异也仅有,2.7,倍。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第22页,Fig.2.,图讲解明,然而，当培养基中,Glu,被逐步消耗时，基因表示整体情况可发生显著改变。,大约,710,个,基因,mRNA,水平被诱导,最少增加了,2,倍,;,大约,1030,个,基因,mRNA,水平,下降了最少,2,倍,;,183,个,基因,mRNA,水平最少,增加了,4,倍,;,203,个,基因,mRNA,水平最少,降低了,4,倍,。,当前，这些表示不一样基因中大约有二分之一其功效还没有被认识，而且也没有命名。相对于那些功效已知基因而言,400,多个表示不一样基因没有显著同源性,.,所以，这些以前还未被认识基因对双峰转换应答，首次为了解它们作用提供了有益线索。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第23页,红框白字,确定了在双峰转换中表示增加基因。,绿框深绿字,确定了在双峰转换中表示降低基因。,黑白框表示无显著差异表示（小于,2,倍）。,连接可逆酶促反应步骤箭头方向，表示从基因表示情况中推断出双峰转换后中间代谢物代谢方向。,基因被强烈诱导表示酶催化反应步骤，用,突出红色箭头,表示。,宽灰色箭头表示从基因表示情况中推断出双峰转换后代谢物主要增加流向。,Figure 3.,Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression.,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第24页,Fig.3.,从基因表示改变全局分析中推断得到糖代谢调整图谱。,图中,只确定了关键中间代谢产物。,编码代谢通路中催化每一步反应酶酵母基因名字在方框中给出。,编码琥珀酰,CoA,合成酶和肝糖脱支酶基因还未明确判别（给出），但,ORFs YGR244,和,YPR184,分别表现出与琥珀酰,CoA,合成酶和肝糖脱支酶显著同源性，所以被标注在该图对应步骤中。,红框白字确定了在双峰转换中表示增加基因。,绿框深绿字确定了在双峰转换中表示降低基因。,这些基因诱导和抑制程度在图中也显示出来。,对多亚基酶复合体，如琥珀酸盐脱氢酶，标注诱导倍数代表框中所列全部基因一个无关紧要平均数。,黑白框表示无显著差异表示（小于,2,倍）。,连接可逆酶促反应步骤箭头方向，表示从基因表示情况中推断出双峰转换后中间代谢物代谢方向。,基因被强烈诱导表示酶催化反应步骤，用突出红色箭头表示。,宽灰色箭头表示从基因表示情况中推断出双峰转换后代谢物主要增加流向。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第25页,Fig.3,图讲解明,那些功效已知基因在表示过程中所表现出各种改变，这些改变为咱们展现了一幅细胞经过何种方式有效适应环境改变鲜明生动图画。,图,3,显示了与糖代谢和能量代谢相关酵母代谢路径。咱们将观察到,mRNA,编码每一个酶改变，经过图解标注在一个代谢通路框架上，从而使咱们能据此推断代谢体系中代谢物代谢去路。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第26页,Fig.3,图讲解明,试验中，咱们观察到醛脱氢酶,(,ALD2,),和乙酰辅酶,A,合成酶,(,ACS1,),被大量诱导合成，这两种酶作用就是一起将乙醇脱氢酶产物，即乙醛，转化为乙酰辅酶,A,，而乙酰辅酶,A,则深入参加三羧酸循环（,TCA,）和乙醛酸循环（支路），为其提供能量原料。,伴随编码丙酮酸脱羧酶基因转录停顿和丙酮酸羧化酶诱导合成，从而使丙酮酸代谢转向合成草酰乙酸，而不再生成乙醛，为,TCA,循环和糖异生提供原料。,因为编码磷酸烯醇丙酮酸羰激酶基因,PCK1,和编码,1,6-,二磷酸果糖基因,FBP1,两个关键基因被诱导转录，逆转了糖代谢过程中两个不可逆反应代谢方向，从而使代谢沿着糖酵解路径可逆反应逆向朝着合成,-,磷酸葡萄糖（,6-P-G,）方向进行。,诱导编码海藻糖合成酶和糖原合成酶复合体基因转录，可深入促进,6-P-G,转化合成海藻糖和糖原进入糖储存路径。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第27页,Figure 4.,Coordinated regulation of functionally related genes.,曲线代表在每个指定组中全部基因平均诱导和抑制率。,几类基因，如,细胞色素,C,相关基因，和那些参加,TCA/,乙醛酸循环和糖储备反应路径相关基因，在葡萄糖消耗时,它们同等地,被诱导表示,。,相反，,蛋白质合成相关基因,，包含,核糖体蛋白，,tRNA,合成酶，和翻译、延长及初始因子基因,等，则表现出同等程度地,表示降低,。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第28页,Fig.4.,功效性相关基因协同调控,各群组中基因总数以下：,核糖体蛋白，,112;,转录延长和起始因子，,25;,tRNA,合成酶,(,不包含线粒体合成酶,),17;,肝糖原和海藻糖合成和降解，,15;,细胞色素,C,氧化酶和还原酶蛋白，,19;,TCA,和乙醛酸循环酶，,24,。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第29页,正如编码关键酶基因表示改变能增强对代谢程路径调整调认识一样，大批量功效相关基因表示行为分析，能够为研究酵母细胞适应多变环境系统方法提供宽广视野。,几类基因，如细胞色素,C,相关基因，和那些参加,TCA/,乙醛酸循环和糖储备反应路径相关基因，在葡萄糖消耗时它们同等地被诱导表示。,相反，蛋白质合成相关基因，包含核糖体蛋白，,tRNA,合成酶，和翻译、延长及初始因子基因等，则表现出同等程度地表示降低。,在双峰转换过程中，超出,95%,核糖体基因表示最少降低,2,倍（,Fig.4,）。,一个值得注意且有启发性,例外,是,编码线粒体核糖体基因在葡萄糖限制后通常是被诱导，而不是被抑制,，这,对线粒体生物发生是十分必要,。,当从酵母基因组中了解到更多关于每个基因功效时，经过其全体基因表示模式取得深入了解细胞适应环境改变能力将变得愈加强大。,Fig.4.,图讲解明,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第30页,Figure 5.,Distinct temporal patterns of induction or repression help to group genes that share regulatory properties.,细胞密度时序分布图,只在最终时间点（,20.5,小时）表现出强诱导（大于,9,倍）,7,个基因,7,个在,18.5,小时时间点早期诱导时,mRNA,水平上有一个峰。,细胞色素,C,氧化酶和泛醌细胞色素,C,还原酶基因。有一个与双峰转换一致诱导标识,双峰转换前被抑制，并连续抑制进入稳定阶段基因,核糖体蛋白基因包含一大类被抑制在葡萄糖降解（阶段）基因。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第31页,Fig.5.,诱导和抑制不一样时序模式有利于将基因依据它们共同调控特征分为对应组：,细胞密度时序分布图，在,600nm OD,测定和基质中葡萄糖浓度。,7,个基因表现强诱导（大于,9,倍）只在最终时间点（,20.5,小时）。除,IDP2,外，这些基因每一个都有一个,CSRE UAS,。没有发觉适合这张分布图额外基因。,被标识一类基因中有,7,个在,18.5,小时时间点早期诱导时,mRNA,水平上有一个峰。这些基因中在上游开启子区域都含有,STRE,重复基序。,细胞色素,C,氧化酶和泛醌细胞色素,C,还原酶基因。被一个与双峰转换一致诱导标识，这些基因都含有一个,HAP2,3,4,蛋白复合体识别共有结合基序。最少,17,个基因含有相同表示分布图。,SAM1,GPP1,和几个未知功效基因在双峰转换前被抑制，并连续抑制进入稳定阶段。,核糖体蛋白基因包含一大类被抑制在葡萄糖降解（阶段）基因。这些基因在其开启子上游都包含一个和多个,RAP1,结合基序。,RAP1,是大多数核糖体蛋白中一个转录调控子。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第32页,Fig.5,含有相同表示分布图来自额外群组基因例子在,Fig.5,C,到,F,中显示。,在,Fig.5C,中，已命名基因上游序列都含有应激反应元件（,STRE,），但,HSP42,例外，以前研究表明它们最少个别受这些调控元,件,(21-24),。,Fig.5C,中显示对,HSP42,和两个未描述特征基因,(YKL026c,，一个与谷胱甘肽过氧化酶有相同性假想蛋白；,YGR043c,，一个假定二羟丙酮基转移酶,),上游序列进行研究,，揭示这些基因中也都有应激反应基序,CCCCT,上游重复序列。,在这张表示分布图上酵母基因组中,13,个额外基因中（包含,HSP30,ALD2,OM45,和,10,个未表明特征开放阅读框（,ORFs,）（基因,）,(25),），有,9,个在其上游区域含有一个和多个可识别,STRE,位点,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第33页,Fig.5,异源三聚体转录活化因子复合体,HAP2,3,4,已显示对呼吸过程中几个至关主要基因诱导发挥作用,(26-28),。该复合体结合一个简并性共有序列，已知为,CCAAT,盒子,(26),。利用共有序列,TNRYTGGB,进行计算机分析，已提醒参加呼吸作用大量基因可能为,HAP2,3,4,特定靶点,(,30,),。确实，在,7,个细胞色素,c,相关基因每一个基因上游序列中，均能发觉一个假定,HAP2,3,4,结合位点，这,7,个基因显示出最大程度诱导表示,(Fig.,5,D),。在,12,个被诱导表示额外细胞色素,C,相关基因中，除一个例外，其余,11,个都有,HAP2,3,4,结合位点。值得注意是，咱们发觉，伴随双峰转换，,HAP4,本身转录诱导差不多达,9,倍。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第34页,Fig.5,核糖体蛋白生物合成调控主要在转录水平，经过存在一个相同上游激活元件进行，该元件可被,Rap1DNA,结合蛋白识别,(,31,32,),。,Fig.,5,F,显示了,7,个核糖体蛋白表示分布图，对,7,个基因上游序列分析显示均存在共有,Rap1,结合基序,(,33,),。这提醒，在饥饿状态下，细胞内,Rap1,水平降低可能是造成核糖体蛋白表示下降原因,(,34,),。确实，咱们观察到在葡萄糖耗尽时，,RAP1,mRNA,丰度降低了,4.4,倍。,在,149,个编码已知或假定转录因子基因中，只有,HAP4,和,SIP4,2,个基因在双峰转换时被子诱导增加,3,倍。,SIP4,编码一个,DNA,结合转录活化因子，该因子可与葡萄糖抑制主要调控因子,Snf1,相合,(,35,),。,在葡萄糖降解时,SIP4,诱导增强,8,倍有力地提醒，在双峰转换中,SIP4,可能对,诱导下游基因表示发挥主要作用。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第35页,结 语,使用,DNA,微阵列来描述受调控分子活动影响突变转录结果，为分析和了解调控路径和网络提供了一个简单而有力技术方法。,这种策略一样在药品筛选中也含有主要应用价值。,在编码候选药品靶蛋白特定基因中，基因突变能够作为基因表迖理想化学抑制剂或调整因子代用具。,DNA,微阵列可被确定基因表示造成信号模式改变，然后分析来筛选能够产生理想信号模式化合物。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第36页,结语,在基因组水平上探索基因表示模式，,DNA,微阵列为此提供了一个简单而经济技术方法。,将这一方法扩展应用到任何其它组织均没有多大障碍。,生产和使用,DNA,微阵列所需设备可选择价格适中和简单组件。,对一个研究小组来说，只要得到基因序列，在,4,个月内完成,6000,多个基因扩增是可行，而且只需,2,天就可印制一套,110,型微阵列，每个微阵列有,6400,个单元。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第37页,结语,探针制备、杂交，以及荧光显像也都是很简单操作过程。,甚至概念上简单试验，象咱们这里所描述一样，均能够产生大量信息。,如同每个基因功效被了解得更多，别试验方法一样能够确定众多其它自然过程和遗传影响中基因表示全局改变一样，每个这种试验所提供信息价值也将不停增加。,可能当前最大挑战是发展有效方法，以利于从试验提供大量数据中组织、分配、解释和提炼观点、看法。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第38页,