筛选标记和目的基因.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,筛选标记与目的基因,杨旭,160919012,1,筛选标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。,在基因工程意义上来说，它是重组,DNA,载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否,筛选标记基因在遗传转化中担负着区分转化体和非转化体的重要作用。,合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是转基因成功的关键。,2,1.,新霉素磷酸转移酶,II(NPT II)(npt II),npt,基因最初是从大肠杆菌转座子,Tn5,中分离得到的，即氨基糖苷磷酸转移酶,基因，它编码的氨基糖苷磷酸转移酶使抗生素被磷酸化而失活。因此,npt,基因作为筛选标记基因可以使转化细胞对抗生素如卡那霉素、,G418,、巴龙霉素、新霉素等产生抗性，进而达到筛选的效果。目前，该基因仍是植物基因工程中运用很广泛的选择标记基因。,2.,潮霉素磷酸转移酶,(HPT)(hpt),从大肠杆菌中分离出来的,hpt,基因可以编码,HPT,，使其具有潮霉素,B,的抗性。,hpt,基因被证明是单子叶植物较为理想的筛选基因，因其选择效率高、基因型差异小、对转化细胞不产生或很少产生毒害作用、再生的转基因植株育性较好等优点在水稻、玉米和小麦等作物上得到了广泛应用。目前，大多数转基因水稻的有关研究中，均以,HPT,作为抗性选择标记。,3,3,.,草丁膦,N,乙酰转移酶,(PAT)(bar),编码,PAT,的,bar,基因最初是从吸水链霉菌中分离出来的。,PAT,能使草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使草丁膦对植物无毒害作用。,这种筛选体系具有快速简便、高效，细胞产生的假转化体少，并且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点。它是目前用得最多的选择标记基因之一。,4.,-,微管蛋白基因,从牛筋草中分离得到的,微管蛋白基因突变体对二硝基苯胺类除草剂,(TFL),具有抗性。目前，已经作为筛选标记基因应用于单子叶植物和双子叶植物遗传转化研究工作中。,4,5.,磷酸甘露糖异构酶,(PMI)(manA),编码,PMI,的,manA,基因最初是从大肠杆菌中分离提取出来的，目前在酵母、动物及人体中都已分离得到编码该蛋白的基因。然而，除肉桂和一些豆类外，自然界的植物中大都没有编码,PMI,的基因，因此以甘露糖为筛选剂的筛选体系在绝大多数植物的遗传转化中都可以应用。并且被证明对环境和人体健康都十分安全。但是容易受到培养基或外植体内其他糖类水平等生理因素的干扰，因此该筛选体系的完善还有待进一步的研究。,5,6.,木糖异构酶,(xylA),xylA,基因是由赤褐色链球菌和嗜热厌氧杆菌中分离出来的。木糖是半纤维素的主要组成部分，是生物体内含量仅次于葡萄糖的糖类。同甘露糖一样，木糖也是许多植物细胞不能代谢利用的糖类，例如烟草、马铃薯和番茄不能用,D-,木糖作为唯一碳源。然而木糖异构酶,(D-sylose ketol-isomerse),可以催化木糖成为,D-,木酮糖，,D-,木酮糖可作为碳源。这种筛选方法比,nptII,基因的筛选效率高,10,倍左右，并且发芽更快。研究证明这种酶是生物安全的并且在食品工业中得到普遍应用。,6,7.,拟南芥,ATP,结合域,(ABC),转运蛋白,ABC,蛋白是植物中普遍存在的蛋白质。在,ABC,蛋白质家族中它们有,30%,40%,的结构是相似的。拟南芥,ABC,转运蛋白是依据它们结构域的同源性来分类的，但是它们的功能还不是很清楚。植物基因,Atwbc19(2 178 bp),编码一种特殊的拟南芥,ABC,转运蛋白，这种蛋白可使转基因植株具有卡那霉素的抗性。但是这种抗性机制与转基因烟草用的,CaMV 35S,启动子启动细菌抗药基因的表达机制是不同的。由于,ABC,转运蛋白是植物内源蛋白，所以在同样的抗性基因遗传转化工作中,Atwbc19,作为筛选标记可以替代现在应用广泛的细菌标记基因。因此这种标记基因可能对于农业转基因研究来说是具有应用价值的。,7,8.,色氨酸合酶,beta1(TSB1),色氨酸,(Trp),是一种存在于植物中的必需氨基酸，它不能在动物中合成。通常状态下植物并不合成,Trp,，只有处于伤害环境等胁迫条件下才诱导合成,Trp,。在植物中，,AtTSB1,基因的主要作用是将吲哚和丝氨酸转变成为,Trp,。目前，,Hsiao,等研究发现,AtTSB1,基因在植物转基因中可以作为一种新颖的非抗生素筛选标记，对,5-,甲基色氨酸,(5MT),或重金属的选择既简便又快捷。在含有,75,M 5MT,或者,300,M CdCl 2,的,MS,培养基上筛选转化植株效果很明显。通过以上研究结果得出结论，,AtTSB1,转基因植物中积累,Trp,可以限制,Cd 2+,和其他重金属的增加，或者抑制金属转运物的活动。因此，重要的禾本科作物应用,AtTSB1,基因作为筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金属污染的土壤中。,8,9.,氨基糖苷腺苷酰转移酶基因,(aadA),双子叶植物叶绿体转化多采用,aadA,基因，用壮观霉素,(spectinomycin),进行筛选，获得同质叶绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大，分化植株的前期筛选一般,2,8,个月，甜菜叶绿体转化筛选,8,个月后才分化植株。棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植株则长达,18,个月。单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性，因此，水稻叶绿体转化时,aadA,基因的筛选采用链霉素，链霉素的作用机理主要抑制非转化细胞分化绿苗和根的形成，愈伤组织阶段筛选效果很不明显，后期分化绿苗以及生根阶段效果才体现出来，其作为禾本科作物的筛选标记，效果并不理想。,9,报告基因（,reporter gene,）,是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其与目的基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控。,报告基因的基本单元包括启动子和报告基因两个部分。其中报告基因编码易检测蛋白或酶，而启动子则调控序列表达。,10,报告基因的选择原则,报告基因的产物和蛋白活性的定量检测方法容易建立，并且快速简便，灵敏度高，重现性好,在被转染的宿主细胞中不存在报告基因产物或类似的内源性物质,报告基因表达率与目的基因转录水平同步,11,1,报告基因的类型和特点,1.1,氯霉素乙酰转移酶基因（,CAT,）,氯霉素乙酰转移酶 基因最早应用于检测哺乳动物中的基因表达,.,作为报告基因，氯霉素乙酰转移酶基因表达产物比较稳定，且在活性很低的水平就能被检测出来,.CAT,能催化氯霉素乙酰化反应，将乙酰基从乙酰辅酶,A,转移到氯霉素的,3-,羟基位上，再通过测量放射性标记的底物实现量化,.CAT,在真核细胞中的本底很低，结果重现性好且灵敏度高，是真核基因表达调控研究中最早使用的报告基因之一,.,然而，由于依赖放射性元素，存在对操作者和环境的安全性问题，因此其应用前景受到了一定的限制,.,与之类似的报告基因有潮霉素磷酸转移酶（,HPT,），,-,葡 糖 醛苷酶基因（,GUS,）等,.,12,1.2-,半乳糖苷酶基因（,-,galactosidase,）,-,半乳糖苷酶 是大肠杆菌乳糖操纵子中,lacZ,基因的产物，在遗传学、细胞生物学和分子生物学研究中广泛应用于监测和校正转染效率,.,-,半乳糖苷酶能催化包括乳糖在内的各种半乳糖苷的水解,.,大肠杆菌,-,半乳糖苷酶比较稳定，易于检测且无需放射性元素，相对于,CAT,有更好的优越性,.,-,半乳糖苷酶根据所使用的不同底物的情况，浓度低至,1 amol,都可以被检测出。,13,1.3,荧光素酶基因（,Luc,）,荧光素酶 是指能催化不同底物（如荧光素、腔肠素等）发生氧化使其发射出荧光的一类酶的总称。目前最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶（,BL,）和萤火虫荧光素酶（,FL,）两大类。,FL,的检测线性范围宽达,7,8,个数量级，检测灵敏度可达,10-19 mol,（比,CAT,高,100,倍），现已成为哺乳细胞中的最常使用的报告基因,.,高灵敏度、多用途、半衰期短、背景极低和相对简单的分析方法是萤火虫荧光蛋白流行使用的主要原因,.,常用的检测荧光素酶的方法有液闪法和光照度计法,.,随着具有膜透过性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的发现和使用，无需裂解细胞即可检测酶的活性,.,14,1.4,荧光蛋白基因,荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为,2030 kD,的同源性蛋白，包括绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白等。绿色荧光蛋白（,GFP,）是其中应用的最多的一种，最初是从维多利亚发光水母（,Aequorea victoria,）中分离得到,.,下村修在研究水母的发光机制时发现腔肠素（,coalenterazine,）和钙离子与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激发,GFP,，使其发绿色荧光,GFP,是一条由,238,个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为,27kD,，用,395 nm,的紫外光和,475 nm,的蓝光激发，,可在,508 nm,处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物,.,15,GFP,相对分子质量小、荧光稳定、对活细胞无害、检测方法容易，还可以用流式细胞仪对悬浮细胞进行高灵敏度和特异性检测，加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶等作用均不能使它灭活,.GFP,的上述诸多优点已使其成为众多报告基因中的后起之秀，被称为“活细胞的分子探针”,.,然而，,GFP,在某些特定的细胞中不表达，因此在实验前需要进行目的细胞和检测手段的初选,.,此外，由于野生型,GFP,无放大作用，因此它比荧光素酶灵敏度低,.,自从,1991,年,GFP,基因克隆以来，已经有多种,GFP,突变体问世，有蓝绿色荧光蛋白（,CFP,）、黄色荧光蛋白（,YFP,）和蓝色荧光蛋白（,BFP,），它们都显现出优于野生型,GFP,的特性,16,2,报告基因的应用,报告基因能实时定量检测细胞活动和生理化学物质的变化情况，并且具有实时性、非侵入性、可靠性、易检测、可重复性、高敏感性、可用于大规模检测等优点，因此在植物基因工程、动物基因表达调控、分子显影影像学、启动子活性分析、基因转移分析、信号转导通路研究、受体功能鉴定、细胞毒性检测、生物大分子的相互作用、药物开发的生物筛选等诸多领域都有广泛的应用,.,17,2.1,报告基因在植物学研究中的应用,在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要是抗菌素抗性基因和编码催化人工底物形成荧光物质的酶基因。,前者常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（,CAT,）、新霉素磷酸转移酶,基因（,NPT,）、潮霉素磷酸转移酶基因（,HPT,）,以及庆大霉素转移基因等，后者则包括,-,葡糖醛苷酶基因（,GUS,）、萤火虫荧光素酶基因（,Luc,）和绿色荧光蛋白基因（,GFP,）等。,新霉素磷酸转移酶,基因（,NPT,）来自大肠杆菌,aphA2,基因，是目前在植物基因转化中应用最广泛的选择标记基因,18,2.2,报告基因在动物学研究中的应用,在动物基因表达调控的研究中，经常会使用到报告基因,.,常用的有氯霉素乙酰转移酶基因、,-,乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等,.,目前应用较多的是,GFP,的突变体,增强型绿色荧光蛋白（,eGFP,），发射出的荧光强度比,GFP,强,4,35,倍，因此，比,GFP,更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。,荧光素酶基因可用于标记基因、细胞和活体动物,.,19,2.3,报告基因在微生物学研究中的应用,生物环境工程研究的重要工具,.,微生物环境工程研究中使用的报告基因有对有毒化学物质苯喃（,Benzofurans,）响应的,SOS,细胞分离抑制基因，钴离子诱导的半乳糖苷酶基因和钙离子调节的荧光素酶基因等。操纵子参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫氧化代谢过程，并通过特异性调控蛋白对底物,Na 2 S 2 O 3,的诱导作用产生响应,.,作为一种简便有效的方法，报告基因在微生物检测和调控研究中正发挥着越来越重要的作用,.,20,