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磁性粒子在体外分子诊断中的应用：从样本制备到微系统
Magnetic particles for in vitro molecular diagnosis: From sample preparation to integration into microsystems
与分子诊断相关的磁性胶体粒子（Colloidal magnetic particles，MPs）已经发展很多年了，其优势在于能够很容易的使用磁体进行操控。可以快速简单的从生物分子中捕获并分离出核酸，然后进行检测。可在磁珠的表面进行修饰，覆盖多种聚合物材料，形成多种功能以满足不同的应用需求。这些存在于磁珠表面，拥有特异活性的物质使其检测特异性和灵敏度得到增强。实际应用中磁珠比传统方法更高效。磁珠作为“智能载体”已经超越传统检测被成功用于微流控和芯片实验室等生物传感器中。由于其多功能性，磁珠多被整合进小的单个检测单元。使用磁珠的生物传感器有利于对很小量的样本进行快速和高灵敏度的检测。从样本制备到分析读取系统，本文主要综述磁珠在核酸检测中的应用。此外还介绍了用于核酸检测的现代化集成微系统（包含微流控和芯片实验室生物传感器）。
主要内容
1. 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. 样本制备中的胶体磁珠. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1. 胺化聚合物包被. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. 羧化聚合物包被 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3. 共价交联. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. 分子检测和结果读取系统中的胶体磁珠
3.1. DNA 扩增中的分离作用 . . .
3.2. 分析过程中的信号支撑.
4. 微流控和芯片实验室生物传感器中的胶体磁珠
5. 总结
∗Corresponding author. E-mail address: [e-mail] (K. Jangpatarapongsa). http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2017.06.024

1、 前言
近几十年来，各种各样的胶体粒子已经广泛的应用于生物医学领域，例如生物影像、靶向药物运输、药物疗法和生物医学诊断。因为易于用磁体进行操控，磁珠在生物医学领域的应用最为广泛。生物兼容性、高色散度、和高比表面积等优势使得磁珠在生物分子的量化分析中起重要作用。根据不同的功能，磁珠被分别应用于不同的检测方法中。通过在表面包被不同的多聚物材料和其他生物组分，能够制造出各种有特定用途的磁珠。
从发现循环核酸（包括血浆和血清中的DNA和RNA）以来，在多种疾病的分子诊断中其已成为最重要的靶标。通过检测与病原体或基因突变相对应的循环核酸能够区分出病患和健康人群。此外，检测的灵敏度必须要很高才能识别出样本中微量的靶标核酸。对一些疾病来说，想要实现精准诊断，对靶标分子的高灵敏度和特异性的定量分析至关重要。PCR技术，一种能把少量拷贝的DNA分子扩增至百万级别拷贝数的分子技术，提高了分子诊断的水平。以PCR为基础，发展出了很多后续的检测技术，如实时荧光PCR、环介导等温PCR、滚环复制和双环复制（两轮滚环复制）。尽管通过不断改进，PCR使用性不断增强，但扩增后使用琼脂糖凝胶电泳来检测产物操作复杂，耗费时间，存在非特异性扩增和产物污染问题。目前为止，以PCR为基础的改进技术中，实时荧光PCR是最先进的，其使用DNA嵌入荧光染料进行实时分析。该技术需要优化反应条件和考虑染料和扩增产物双链DNA质检的非特异性结合。在此，为了提高特异性，磁性磁珠被应用到生物分子的分析当中，如：生物分离和特异性标记粒子。除了特异性，以单个粒子为基础的应用也使得检测灵敏度得到提升，如荧光微阵列、功能化的生物传感器和微流控系统。
本文主要关注磁性磁珠在分子诊断领域的应用，特别是基于PCR的检测方法和相关流程。阐明了两个主要方面的技术应用。第一是样本制备和靶标分子提取中使用的基于粒子的分离方法。第二是分子检测和读取系统中使用的功能化的磁珠，包括磁免疫PCR、微流控生物感应器和芯片实验室微系统。此外，在分子检测中所使用磁珠的合成和功能化也会有所论述。
2、 样本制备中的胶体磁珠
含有核酸序列的遗传物质，包括DNA和RNA，是基于PCR的多种疾病检测技术的主要靶标。在基于PCR的检测过程中，为了去除样本中的PCR抑制因子和残留的污染物，需要对靶标DNA/RNA进行提取和纯化。传统的核酸提取和纯化方法依赖于化学试剂的处理，如需要离心的苯酚-氯仿和柱层析法。这些传统的方法需要的样本量较大，在洗涤过程中会损失DNA。胶体粒子可以增加提取和纯化的效率。由于其固有优势，球形粒子适于分子生物学应用。通过快速简单处理，胶体粒子被用于提取、纯化和预富集。根据不同的应用目的，可选用不同的材料去合成胶体粒子。
作为分离试剂，磁珠被用于样本制备。氧化铁，包括Fe3O4和γ-Fe2O3，由于其生物兼容性、低毒和制备方便等特性被广泛应用。无需任何修饰，Fe3O4 磁珠本身就能吸附DNA；然而带阴性电荷的磁珠会减少DNA结合力并能轻微的增加不均匀聚集。为了增加磁珠的效率和种类，通常会在粒子表面包被其他材料，以实现功能的多样化。
2.1胺化聚合物包被
磁珠表面包被聚合物能够增加其稳定性，使其表面免受氧化，减少在无磁力条件下的聚集。在磁珠表面包被氨基硅烷类物质，如：氨乙基乙醇胺（AEEA），能够提高磁珠对DNA的结合和释放能力。硅烷化的AEEA随后用树状大分子修饰，如胺型树状大分子，能够增加阳离子特性，减少聚集，为DNA结合提供更大的表面。树形大分子包被与DNA的结合和释放效率直接相关联。（Fig.1）

Fig.1 磁珠表面包被了硅烷化的树状大分子以利于DNA结合。
2.2羧化聚合物包被
功能化的羧基修饰磁珠可在高浓度NaCl的条件下吸收DNA。DNA与磁珠表面的羧基基团通过氢键相结合。NaCl的存在还能促进含有疏水含氮碱基的DNA从水相中盐析出来结合到粒子上。可通过几种物质的修饰，来实现羧基基团的功能化，如：甲基丙烯酸、磷酸和二巯基丁二酸。 其他还有与(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride) 聚合物的共价结合修饰，此方法能够快速的在阳离子磁珠表面包被功能化的羧基基团。
2.3共价交联
通过在粒子表面固化上特异的寡核苷酸片段，能够增强磁珠分离核酸的能力。为实现此功能，需要通过交联剂（如戊二醛和碳化二亚胺）的共价结合，把氨基化的核苷酸片段固化到磁珠表面。比如在戊二醛和氯化钠-柠檬酸缓冲液（SSC）作用下，5’氨基修饰的核酸片段能被固化到氨基化的Fe3O4磁珠表面（Fig2）。经固化修饰的磁珠能与靶序列互补杂交，从多种样本DNA中捕获靶标DNA。杂交捕获的效率与磁珠表面的氨基基团的密度直接相关。捕获的DNA可在85℃条件下从磁珠表面洗脱下来。也可不经过洗脱步骤，直接扩增靶标DNA。尽管固化有探针的磁珠可能降低PCR扩增效率，而这种影响与磁珠的剂量相关，但通过含有BSA和甘氨酸溶液的处理，扩增能力会得到恢复。这些研究进展不仅能够被用于多种样本的处理，还能适应新的检测方法。

Figure 2 通过戊二醛，寡核苷酸固化到氨基化的磁珠表面。

3、分子检测和读取系统中的胶体磁珠
特异标记和灵敏度分析中应用的使用抗原和抗体偶联磁珠的读取系统在别处讨论，本文仅讨论各种应用中所使用的功能化磁珠，如分析过程中的分离和信号支持
3.1. DNA 扩增中的分离作用
整合有免疫材料的免疫PCR (IPCR)，在20世纪90年代被开发出来，随后发展成为一种高灵敏度的核酸检测方法。IPCR采用与酶联免疫技术相似的原理，即，依赖于免疫结合和酶底物系统的色度定量法。功能化的磁珠可以有效富集靶标磁，提升IPCR检测性能。很多文献报道：通过固化抗体的磁珠与抗原互作，可以提供特异性捕获以及强力的富集作用。对检测抗原的磁免疫PCR（M-IPCR）来说，特异的抗体磁珠和抗体DNA偶联分别被用于磁性分离和RT-PCR检测中信号发生，要比传统的磁珠酶免法（magneto-ELISA）拥有更高的灵敏度。抗原抗体互作的应用最终催生使用生物素-链亲和素偶联DNA扩增。磁纳米颗粒（MNPs）-PCR酶联基因分析（MELGA），由固化在磁珠上的正向引物和生物素化的反向引物再加上使用链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(SA-HRP)和2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)的色度读取系统构成的PCR扩增，被开发出来弥补一些缺陷，如费时费力，仪器昂贵和有毒试剂。在此系统内PCR扩增子被双重标记，且能通过磁性分离出来，然后通过酶底物互作显色分析（Fig3）。MELGA被用于生物医学诊断，检测多种靶标基因。如：用于检测慢性粒细胞白血病病人的BCR/ABL融合基因，具有高特异性，且达到亚飞克级灵敏度，比传统检测方法高1000倍。磁珠还被应用于等温扩增，如：LAMP、RCA和C2CA，使DNA的分离和检测灵敏度能够更快更高。

除了偶联生物素-链亲和素，还有其他的DNA探测方法。被双重标记的DNA靶标序列，固化探针的磁珠和其他非磁性材料分别起靶标捕获和感知探针的作用，而氨基化的磁珠被用于靶标分离，以N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 和 N-hydroxysuccinimide 作为交联剂，将带有羧基基团的多壁纳米碳管（MWNTs）共价结合到氨基修饰的DNA探针上。磁珠-MWNTs-靶标DNA三明治结构会产生光散射信号，通过紫外分光光度计检测该信号，即可达到检测靶标的目的（Fig4）。此外最近有报道使用金纳米颗粒作为标记探针检测利士曼原虫DNA。该检测方法分别用引物标记的磁珠和金纳米颗粒作为捕获和感知元件，双重标记等温扩增出的DNA，然后在丝网印刷碳电极上的磁铁作用下富集，此电极可感知金纳米颗粒的电信号，以此提供检测信号。综上所述，磁珠可以和非磁珠物质结合使用来检测DNA，具有高特异性和重复性。

Figure 4 三明治结构LS信号检测。靶标DNA被磁珠探针（MP-P1）和多壁纳米碳管探针（MWNTs-P2）双重标记。

3.2. 分析过程中的信号支撑.
使用磁镊技术可使磁珠可作为检测DNA的信号产生器，例如测量单个DNA分子产生的扭矩力等。固化有探针的磁珠可识别靶标分子并在磁场的作用下产生扭矩力。该过程被广泛应用到DNA、蛋白和酶机制的分析当中。磁珠除了作为靶标的捕获工具外，利用其固有的催化活性也能生成可被探测的色度信号。一些研究表明功能化的磁珠拥有与过氧化物酶相似的活性，能够在过氧化氢存在的条件下催化过氧化物酶底物，产生可探测的色度信号。羟基化的磁珠结合沙眼衣原体核酸扩增产生色度信号。表面有催化活性羧化物聚合磁珠（MPNP）进行霍乱弧菌核酸的分离和扩增，该方法对细菌检测具有高效性，灵敏度可达103CFU/ml（Fig.5）。鼠伤寒沙门式菌扩增产物的检测使用一套快速有效地系统（该系统包括连接有DNA适配体的磁珠和3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB)底物），能偶在10min内完成分析。使用有氧化活性的CeO2纳米粒子可在1min内产生肉眼可见的简单超快的色度检测。由于多功能性和其他优势特性，在当前的分子应用领域，磁珠已经成为很有前途的材
料。
4、微流控和芯片实验室生物传感器中的胶体磁珠
生物传感器是探测各种各样化学物质和生物分子的一类仪器装置。生物传感器有三个主要的发展阶段：首先，要有特异的生物受体，如酶、抗体或核酸。生物受体要能从样本混合液中识别出特异的靶标分子。其次，生物传感器探测靶标并随后转化为生化学上的变化，如质量、pH、发光、温度等，或是电荷变化，产生可测量的信号，且信号强弱与待分析物的浓度成比例关系。根据生物传感器的应用来分类，如测重量的、测电势的、测温度的和测电流的。最后，相关的信号处理器稳定并评估从传感器得到的信号，从而得到准确和简单的信息。

Figure 5 利用MPNPs固有的催化活性产生色度信号，实现检测目的。

借助于多领域学科的技术支持，多种功能各异的生物传感器被整合并固化到单个的工作单元中。生物传感器使用胶质磁珠可实现靶标分子的分离、操控和检测。而且，近来出现的生物传感器可实现微量探测，包括微流体和芯片实验室微系统，这些系统所需的样本量很少且能进行高通量检测。在微流体平台上，功能化的磁珠可作为DNA杂交的载体以及其他步骤的媒介，如：使用外部磁体和试剂的DNA嵌入和纯化过程。微流体芯片微系统和磁场操控相结合形成可持续的自动化平台，有利于样本处理和DNA分析。
对分子诊断中使用的芯片实验室类生物感应器来说，磁珠最重要的功能就是能够通过磁力操控微滴中的靶标分子。为了使操控更高效，研究处一些磁珠和微滴之间的互作模式，如：粒子提取、微滴形变和含有粒子的微滴的转运。一个检测癌症生物标志物的微滴平台使用硅基超顺磁粒子（SSPs）作为样本制备和靶标分析的载体。SSPs也被整合进DNA提取和纯化系统，可处理微滴，使用RT-PCR和依赖解旋酶扩增来区分生物标记物（Fig.6）。有报道使用表面张力不相容过滤（IFAST）能得到高效的DNA提取和纯化。IFAST使用磁珠进行分离，使用磁场进行操控，在含有不相容油溶液和洗脱缓冲液的腔室中洗脱并分离出靶标DNA（Fig7）。IFAST极其快速，完成整个DNA提取过程仅需要7min，而且样本需求量很少（10微升）。这些小型化的平台均把样本制备过程整合进简单便捷和实时检测系统中。

Figure 6 整合的微流体微滴平台，使用SSP进行样本制备、微滴操控和生物标志物探测。（a）使用V形狭缝和开放气室系统的微流体装置。（b）使用纳米柱和充满矿物油的微型反映池。

Figure 7 使用IFAST技术的DNA提取和纯化过程。
基于微流体平台和芯片实验室微系统搭建的生物传感器以其简单、快捷和方便性在POCT诊断，尤其是PCR相关检测中起重要作用。POCT能够减少反应时间和操作复杂性。为实现POCT，最近一些单个的为装置被引入芯片实验室类生物传感器中，如：整合了杂交诱导聚集（HIA）的红外介导PCR（IR-PCR）可在芯片上对肠道沙门氏菌NDA进行快速扩增和光学分析。IR-PCR可在35min内完成扩增，在旋转磁场的增强下，可在30s内检测到磁珠聚集。随后可对磁珠聚集进行光学检测，并使用Mathematica软件进行半定量分析。还有报道使用具有顺磁性的硅基磁珠对无标记的DNA进行定量分析。通过磁珠和DNA样本简单的在枪头内混合，经过移液、聚集和印迹分析过程实现DNA的定量。通过磁场诱导吸附有DNA的磁珠聚集，在磁场作用下，聚集的磁珠转移到滤纸上，光学扫描成像或使用移动手机拍照成像，随后用使用Mathematica软件的色饱和度模式分析图像中的色饱和度直方图，以此来得出分析结果。这些POCT检测灵敏且简单，代表便携式和无标记DNA定量，适应下一代简单、快速和精细的分子诊断。
5、总结
材料科学和生物医学诊断领域对胶体磁珠的研究已经非常透彻。磁珠已经作为包括DNA在内的生物分子的分离载体被广泛应用。此外磁珠表面的功能化赋予磁珠多种优势和用途，可应用于分子诊断的任何步骤。
胶体磁珠可根据客户要求进行定制，这是其最大的特点。在磁珠上固化各种生物分子能够得到更好地检测灵敏度和特异性。此外磁珠和非磁性材料如：硅石微粒，金纳米颗粒(AuNPs)，多壁纳米碳管（MWNTs） 等相结合，能够扩展其在分子领域的应用范围。纳米技术时代，磁珠和芯片实验室微型分析系统已经被引入微流体平台。最先进的应用已经被用来解决传统方法的局限性。但当前最先进的技术应用也存在一些问题，仍需要不断改进和提高。
总的来说，应用于PCR检测方法的磁珠是当前研究热点。新的磁珠应用不断出现并且不断发展。在样本制备和分析读取系统中的应用证明磁珠对分子诊断来说是不可或缺的。而且磁珠已经被应用到微流体和芯片实验室类生物传感器上。展望未来，磁珠在现代化的分子诊断方法中必将扮演重要角色。使用新材料如，应激高分子聚合物和具有超高灵敏度半导体量子点等，修饰的磁珠将不断扩展材料科学和相关领域研究的界限。