NY∕T 402-2016 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程(农业).pdf

ICS 65.020 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 402一2016代替NY/T402-2000 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程Code of practice for virus detection of virus-free sweet potato seed roots or plant 2016一-01发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 402-2016 目U吕本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T4022000(脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程。与NY/T 4022000相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下:增加了检测甘薯病毒种类(见1、4);一一增加了规范性引用文件(见以一一对脱毒组培茵的定义进行了修改(见3.1, 2000年版的2.1);一一删除了术语和定义中病毒病株允许率，增加了带毒率(见3.6)和病毒病显症率(见3.7); 一一增加了病毒PCR检测方法(见6.3和附录C)和RT-PCR检测方法(见6.4和附录0); 一一根据生产实际重新确定了原种和生产用种的质量标准(见7.3和7.4)。本标准由农业部种子管理局提出并归口。本标准起草单位:江苏徐州甘薯研究中心、河南省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:谢逸萍、张振臣、孙厚俊、乔奇、张成玲、秦艳红、赵永强、张德胜、徐振、王爽、杨冬静。本标准的历次版本发布情况为:一一-NY/T4022000。I NY/ T 402-2016 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程1 范围本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术的术语定义、检测对象、抽样、检测方法和脱毒种薯(苗)的质量标准。本标准适用于脱毒甘薯种2. 1 毒(2.2 2. 4 原种用原原种在2. 5 生产用种certi 用原种在隔离条件下2. 6 带毒率virus-carrying rate 各级别甘薯种薯(苗)受病毒侵染薯块(植株)的比率。2. 7 病毒病显症率virus-syrnptorn rate 各级别甘薯种薯(苗)出现病毒病症状薯块(植株)的比率。3 检测对象3. 1 甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)。3. 2 甘薯潜隐病毒(SPLV)。otato feathery mottle vir， 病毒(Sweetotato virus G, V)、甘薯G病oviruses) 1 NY/ T 402-2016 3. 3 甘薯G病毒(SPVG)。3. 4 甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)。3.5 甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)。3. 6 甘薯双生病毒(Sweepoviruses)。4 抽样4. 1 组培苗抽样4. 1. 1 脱毒组培苗每个茎尖分生组织培养系应检测。4. 2 田间抽样4.2.1 原原种田和原种回抽样定植后30d、60 d、收获前2周，采用五点取样法。面积运o.1 hm2，抽取数量为200株;0.1hm2面积1hm2，抽取数量为500株;超出1hm2面积，按0.1hm210000 抽样百分率，%610 抽样最低数量，株100 4.2.2.2 没有经过田间检测的种薯(苗)应进行块根或种苗检测。抽样数量标准见表2。将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。表2抽样数量标准表种类种薯(苗)总量抽样百分率，%抽样最低数量薯苗10 000株610 100株10000株35 种薯10 000 kg 610 100 kg 10000 kg 35 注:不足抽样最低数量的全部作为混合样品。5 检测方法5.1 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPCFV和SPCSV共5种病毒，检测方法见附录A。5. 2 指示植物检测法用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPCFV、SPCSV和Sweepovires共6种(类)病毒，检测方法见附录B。5. 3 聚合酶链式反应(PCR)检测法用于检测Sweepoviruses。检测方法见附录c5. 4 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法用于检测SPCSVo检测方法见附录D。2 NY/T 402-2016 6 脱毒种薯(苗)的检测程序及质量标准6. 1 脱毒组培苗用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物法进行检测，检测结果均应为阴性，即带毒率为0。6. 2 原原种用NCM-ELISA或指示植物法进行检测，其中10%以上(含)样品分别利用PCR和RT-PCR方法检测。带毒率为006. 3 原种用NCM-ELISA或指示植物进行检测，其中5%以上(含)的样品分别利用PCR和RT-PCR方法检测。SPFMV、SPLV、SPVG和SPCFV的带毒率2.0 % ，SPCSV和Sweepoviruses的带毒率为0，病毒病显症率1.0%。6. 4 生产用种用NCM-ELISA或指示植物进行检测，其中1%以上(含)的样品分别利用PCR和RT-PCR方法检测。SPFMV，SPLV、SPVG和SPCFV的带毒率10.0%, SPCSV和Sweepoviruses的带毒率为0，病毒病显症率5.0%。3 NY/T 402-2016 附录A(规范性附录)硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法A.1 溶液配制所用化学试剂为取脱脂奶粉1.A. 1.8 底物缓冲液取Tris6. 1 g、N9.5，定容至500mL。A. 1.9 氯化硝基四氮瞠蓝(取0.04g NBT溶于1.2 mL A. 1. 10 5-滇-4-氯-3 -051 取0.02g BCIP溶于1.2 mL DMF中，-20oC避光保存备用。A. 1. 11 NBT/BCIP底物溶液少量TBS先后取100LNBT储备液和100LBCIP储备液，加入25mL底物缓冲液中，振摇棍匀，现配现用。A.2 样品制备将待测叶片用清水清洗干净，从每一样品上中下部的叶片上各取一直径约1cm圆片。放入研钵中，加入3mL抽提缓冲液充分研磨，将研磨液加入到5mL离心管中，6000r/mi口，离心2min，取上清液点膜。A.3 操作步骤A. 3.1 点膜NY/ T 402-2016 将划好方格(1cmX 1 cm)的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取15L上清液滴在膜上方格的正中.室温干燥15min30 mino同时设阳性、阴性和空白对照。根据需要设置重复。A. 3. 2 封闭将干燥后的膜浸入封闭缓A. 3. 3 与一抗反应将膜置于用抗体缓r旷/minA. 3. 4 洗膜用洗涤缓A. 3. 5与用滤液中，A. 3. 6 洗A. 3. 7 用A. 3. 8 3 NY/T 402-2016 B.1 繁育指示植物附录B(规范性附录)指示植物检测法在防虫条件下盆栽巴西牵牛(1 pomoea setosa) ，至1片 2片真叶时嫁接。B.2 嫁接以待测样品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为时木，在巴西牵牛的茎部(子叶处)斜切，将待检样品底端削成模形，插入石占木的切口内，用封口膜扎紧，置250C30oC防虫网室内，嫁接15d30 d后观察记载症状。每个样品重复至少3次(3株)，同时设阳性和阴性对照。B.3 结果判断根据巴西牵牛是否表现花叶、叶片扭曲、明脉、黄化以及植株矮化等症状，确定是否带毒。所有嫁接的巴西牵牛植株均没有表现任何病毒病症状，样品为阴性;只要有1株表现病毒病症状，该样品判断为阳性。6 附录C(规范性附录)聚合酶链式反应(PCR)检测法C.1 试剂及缓冲液配制C. 1. 1 TAE电泳缓冲液用下述配方配置50倍的储存液。NY/ T 402一2016取Tris242. 0 g和NazEDTA.2HzO 37. 2 g，加入到1L烧杯中，向烧杯中加入800mL灭菌双蒸水，搅拌溶解，再加入57.1mL冰乙酸，充分搅拌后，用氢氧化纳调pH至8.5，灭菌双蒸水定容至1L。使用时用无菌蒸馆水稀释至工作浓度。C. 1.2 漠化乙链(EB)溶液取澳化乙链20mg溶解于20mL灭菌双蒸水中。C.1.3 1.0%琼脂糖凝胶板取1.0g琼脂糖加入100mL TAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热至琼脂糖融化，温度降至50oC600C时，加澳化乙链溶液5L，摇匀，倒人电泳槽中均匀铺板，凝固后取下梳子使用。C. 1.4 十六皖基三甲基滇化按(CfAB)缓冲液取CTAB20. 0 g、NaCl81. 8 g、乙二胶四乙酸(EDTA)5.8g和Tris12. 1 g，溶于1L蒸馆水中，用HCl调pH至8.0，高温灭菌后加入聚乙烯口比咯;皖酣K30(PVP)10 g。C.1.5 TE缓冲液取EDTAo. 3 g和Tris1. 2 g，溶于1L蒸馆水中，用HCl调pH至8.0，高温灭菌。C. 2 DNA提取采用CTAB法提取植物DNAo具体步骤如下:a) 预热(600C)CTAB缓冲液。b) 取0.5g新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒人盛有预热的600LCTAB缓冲液的1. 5 mL的eppendorf管中，再加入20L琉基乙醇，轻轻混匀。c) 60.C保温1h，其间摇动几次。d) 加入等体积的苯酣/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻混匀，室温下4500 r/min，离心10min。e) 将上清液转入另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，小心混匀后一20.C放置30min以上，可见DNA絮状沉淀。) 10000r/min.离心10mi口，弃去上清液，沉淀加清洗缓冲液(70%乙醇)漂洗2次3次，10000r/min.离心10min，沉淀风干后溶于50LTE缓冲液。开展后续试验或一200C保存备用。C. 3 PCR C. 3. 1 引物正向引物BM- V:5-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC -3;反向引物BM- C: 5-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3。C. 3. 2 PCR扩增7 NY / T 402-2016 PCR扩增体系具体如下:10 X Ex Taq Bufer (含MgCb)dNTP(2. 5 mmol/U Ex Taq DNA聚合酶(5U/L) 引物BM-V(lOmol/U 引物BM-COOmol/U 模板DNAdd H20 总体积PCR扩增程序为:940C 940C 550C 720C 产物与10L1 空白对照C. 3. 5 结果判应用本标准品为Sweepovir8 5. 0 L 4. 0 L O. 5L 1.0 L 1.0 L 2. 0 L 照和NY/ T 402-2016 附录D(规范性附录)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法D. 1 试剂及缓冲液配制D. 1. 1 DEPC7./t|J50 s 10 min 品为SPCSV病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。10