生物信息学实验三步骤加答案(仅供参考).doc

工具软件：
1、VecScreen
2、RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）
3、CpGPlot/CpGReport/Isochore (http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)
4、Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/）
5、Splice Site Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)
6、ORF finder
7、GENSCAN
8、NEBcutter V2.0
9、Genefisher
10、Primer 3.0
11、REBASE
作业：
1、使用VecScreen工具，分析下列未知序列，输出序列长度、载体序列的区域、可能使用的克隆载体都有哪些。
AAGCTATGNACCTGNNTACGNAATTCGNNGCTCGGTGACCCGGGGNTCCTCTAGNGNTGGCCAGNGGACCCCAAGCTTCGGNTGCAGNTACACACACACACACACACACACACNTGGACCAGAAGAACCCCANGCTTCGGATCCCAAGATTTTACTCGTAGGGCTACCCATCACGCACACATATATACCCACACACACACACACACACACACACACACACACACATATGTGCCAGAGACCCCAAGCTTCGGATCAAAATCCGTTCAGTGAGTTTTTGCGTGAAAGAGTAACACACACCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACNCACANNCACACACACACACACACANAGACACATGCTAGTGTATGATGGCCAGAGACCCCAAGCTTCGGATCCGGCTCGACACACACACACACACACAACACACACACAATCGTCGACCTGCNNGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCANCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGANGCGGCATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGNATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNTAAGNAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGNTTAAAGACAAGCTGTGACCGTCTCCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTNCCGNNNTCNCCTGAACGCGCNAGACGAAAGGGCCTNNNGAAACGCCNATTTTATGGGTTAAGG
答：在ncbi工具中搜索vecscreen——将序列复制粘贴到框中——运行---View report--
输出序列长度918、载体序列的区域456-854、可能使用的克隆载体都有
①Cloning vector pRKW2 ② Cloning vector pBR322 ③ Cloning vector pGEM-13Zf(+) ④M13mp18 phage cloning vector

2、使用相应工具，分析下列未知序列的重复序列情况，输出重复序列的区域、包含的所有重复序列的类型、重复序列的总长度及Masked Sequence。
进入ncbi主页---选择blast—填入序列---blast---可看出来这个序列是人类的---搜索RepeatMasker---进入RepeatMasker主页---进入RepeatMasking---复制序列---DNA source选择human----运行---点连接---

GTTTGGGGCCAGAGTGGGCGAGGCGCGGAGGTCTGGCCTATAAAGTAGTCGCGGAGACGGGGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTCCTGCAGCGTCTGGGGTTTCCGTTGCAGTCCTCGGAACCAGGACCTCGGCGTGGCCTAGCGAGTTATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAACATTCCCTTGGATGTAGTCTGAGGCCCCTTAACTCATTGTAGGGAAAAGAAAGAGAGATCAGACTGTTACTGTGTCTATGTAGAAAGCTGTTATCCTGCTAGCTGTAGAAATGTATCCTGATAAACATTAAACACTGTAATCTTAAAAGTGTAATTGTGTGACTTTTTCAGAGTTGCTTTAAAGTACCTGTAGTGAGAAACTGATTTATGATCACTTGGAAGATTTGTATAGTTTTATAAAACTCAGTTAAAATGTCTGTTTCAATGACCTGTATTTTGCCAGACTTAAATCACAGATGGGTATTAAACTTGTCAGAATTTCTTTGTCATTCAAGCCTGTGAATAAAAACCCTGTATGGCACTTATTATGAGGCTATTAAAAGAATCCAAATTCAAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3、使用CpGPlot/CpGReport/Isochore工具，分析下列未知序列，输出CpG岛的长度、区域、GC数量、所占的百分比及Obs/Exp值。
答：进入EMBL→TOOL→sequence analysis→cpgreport→输入序列→run
输出CpG岛的长度为385、区域48-432、GC数量297、所占的百分比为77.14及Obs/Exp值1.01
>gi|31581532|ref|NM_019880.2| Mus musculus mitochondrial carrier homolog 1 (C. elegans) (Mtch1), mRNA
GCCCGCCCGCCATGCCCCCTCGCCCCGCGGCGTGAGTGGTGCTGCCAGGACCCTCCCCTTGACGTTCGGGGGCGTGGCCAGCACCACGTGACGGGGAGTGACCTCCACGCCTGGCGCCATGGGGGCTTCGGACCCGGAAGTGGCGCCTTGGGCTCCCGGCGGCGCCGCGGGGATGGCGGGAGCCGGAGCTGGTGCAGGAGCTCGGGGCGGCGCGCCGGCCGGAGTCGAGGCCCGCGCTCGGGACCCACCACCCGCGCACCGCGCGCACCCTCGCCATCCTCGGCCCGCGGCTCAGCCGTCGGCGCGCAGGATGGACGGCGGCCCGGGCGCCCCGGGCTCCGGGGACAACGCCCCGACCACCGAGGCGCTGTTCGTGGCGCTGGGCGCGGGCGTGACGGCTCTCAGTCACCCGCTGCTCTACGTGAAGCTGCTGATCCAGGTGGGTCATGAGCCGATGCCCCCCACCCTTGGGACCAATGTGCTGGGGAGGAAGGTCCTCTACCTGCCGAGCTTCTTCACCTATGCCAAGTACATTGTGCAGGTGGATGGGAAGATAGGGCTCTTCCGGGGCCTGAGCCCCCGCCTTATGTCCAACGCCTTGTCCACTGTGACCCGCGGCAGCATGAAGAAGGTTTTCCCTCCAGATGAGATGGAGCAGGTTTCCAACAAGGACGACATGAAGACCTCACTCAAGAAAGTTGTGAAGGAGACATCGTATGAGATGATGATGCAGTGTGTATCGCGAATGCTGGCCCATCCCTTACACGTGATCTCGATGCGATGCATGGTGCAGTTTGTGGGACGGGAGGCCAAGTACAGTGGTGTGCTGAGTTCTATTGGGAAGATCTTCAAGGAAGAGGGGCTGCTGGGATTCTTCGTTGGCTTAATCCCTCACCTCCTGGGCGATGTGGTTTTCTTGTGGGGCTGTAACCTGCTGGCCCACTTCATCAATGCCTACTTGGTGGACGACAGCGTGAGTGACACCCCAGGGGGGCTGGGAAACGACCAGAATCCAGGTTCCCAGTTTAGCCAGGCCCTGGCCATCCGGAGCTACACCAAGTTTGTGATGGGGATTGCAGTGAGCATGCTGACCTACCCCTTCCTGCTCGTTGGAGATCTCATGGCAGTGAACAACTGTGGGCTGCGGGCTGGACTCCCTCCGTATTCCCCTGTGTTCAAGTCCTGGATCCACTGCTGGAAGTACCTGAGTGTGCAGGGCCAGCTCTTCCGCGGCTCCAGCCTGCTTTTCCGCCGGGTGTCATCGGGGTCATGCTTTGCCCTGGAGTAACCTAAGCTGCCCGACCAAACATTTATGGGGTCTTAGCCTACCCCTGGTGAGGACCCATCATCTCAGATGCCCAAGGGTGACTCCAGCCCAGCCTGGCTTCATGTCCATATTTGCCATGTGTCTGTCCAGATGTGGGCTGGTGGAGGTGGGTCACCTGGGACCTGGGGAAGCCTGGGGGAGCAGTGTTGGGGTGGCATCCCCTTCCTGCCTAGAGGTACTGGAGTCCATCTTGTACTCAGGCAGAGGCAGGCTGCAGAGGCAAACGTCACTCAGTGGCAAGGCTTCCCTGCACCTCTAGCCCAGCTCATCCTGCCAGTCAGCCAGAAGCACCCCCGCCCCCCACTTCCTGCTTTGTAAATTGGGCGCCATCACACCTGGGCCATGGGAGGCTGGCGCTATGTTCCCAACACTAATTTTCTTATACAAGGGTGGTGCCTTCTCCTGAATAGGAAATCATGTTCTCCTCAGACCATCCCCTCATCTGCTTGTCTGTGCTGGTGACGCCAGGTGTGAGGGTTCAGTCACTGTGCTGGGTGCGAATACGCACAGGTTACATAGGCCGACATCTAGTCCTCCCCTCGTGGTAAGATAGACCCATCTCCTCGAATAAATGTATTGGTGGTGATTTGGAAAAAAAAAA
4、预测下面序列的启动子，输出可能的启动子序列及相应的位置。
Google search ‘Neural Network Promoter Prediction’——choose ‘Neural Network Promoter Prediction’—选eukaryote真核生物—input this sequence-----submit

711-761 TCGCGCCACTATATGATCTGGGCGCCACTCTGGGTGACACAGCAAGACTC
1388-1438 AACCTCTGTGTCTAACGGGGGTGTGTGCTCTCCCTCCTCTGGCGACCATG
1755-1805 GCTGGTGGCATATATAGGGAGGGCTCGGCCTTGGCTCCACACTGGCTGCC

>gi|244474|gb|S79457.1| alpha A-crystallin {5' flanking region} [human, lens, Genomic, 1868 nt]
GATCCTGTGTCCCCGGACAGTGCTGTAAATGTAGGAGGAAGGTGCTGCTCATGGTGCTGCTCATGATGAGTGCCCCAGTGAGCACGCCTCGAGCCCCCCTTTCATCCCTGATCCATCTGGGATGTGTCAGGTCTGATCCGCATACACTGGGCATCTGACATTTCATGGCCTTCTGACGCATGGGCTGAGATGAATTTGCAAAGCCCGGGAGTGTCCTGGGTGTGTGTTCACTCCACACGCACGAATCTGTTAGAGGCTGAGTAGGAACTAGGAGGCCAAAGAGAACCAGGCAACTTCCCACAGCCTGGACCGTACACTAGAAAAGCTAGCCTGGAGAGGGGCATGGCCTCTTCCCAGGCTGGCAGGGGGAATGTGGGGAGGACCATGCTCCCCAGGGCCAGTTTACCAAAATATCAAAATACCAAAATATCAAAAGAACTTAAAACTAGGAGTGAGCCAGGTGCAGTCTCACGCCTGTAATCCTACACTTTGAGAGCCAAGGCAGGTGGGTCACCTGAGGTCAAGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACACGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATTAGCCAAGTGTGGTGGCAGGCACCTGCATCTCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGTGGGAGAATTGTTTGAACCTGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGCGCCACTATATGATCTGGGCGCCACTCTGGGTGACACAGCAAGACTCCATCTCAAAAACAAACAAACAAAACCGGGAGTGCCTGGGACACTTAGTGAGAACTGGACAGGGGCCATGGGTCGAGGAGCAAAATAATCACCAGGACTTGTGGATAACAGGATCATGTGGGTGGTGGGTCCGCATGGGTGACAGGGACGTGGGGACATGTCGCCACCCTGACAGGAGCAGCCCAACTCAACAGCCACGGCAGGTCATGCACGGAGGCTCGAGGCGTTACGTGGGGATGTTACATCAAGGCATTACATCATTACGAGATGTAACGCTCGAGGCGTTACATCGAGGGGACGATGGCATGGGGCTGGGGCGTCCAGGGTGGGCGCAGAGGGAAGCTCAACCACGTGGTGCTCTCATCTGCCCACAGCCCAGCCCGTCTTCCTGTTGGAGGCATGTGACCCCTGGAGGACAAGCATGTGACCCCTGGAGGACAAGCATGAAACGCCATAGGCTCCCCAAGTGCTGAATTATGGCACCTTGCAGCTTCTTCTCCACGACGTTTTAACAAGCGATGCGTACTTTTGTAAGTGGTGAGTGTAACGGAGGTTCACAGATGCACTCCGCTTTGGAAACCAGTGCACTCTTGCCCAGGCCCGGTGAGACTCTGAGGACGATGTGTCTAACCTCTGTGTCTAACGGGGGTGTGTGCTCTCCCTCCTCTGGCGACCATGAGGAAACCCCCGGCAGGACAAGGTGTGCAGAGAACTAGCATGGTCCCTGGCACGTAGCCCCTGCCCAGTGACTGGCAGATGAGAAGCTCCATTGTCGCCCCAGGGAGTATGGGGCACAGGCGCCTCCTTGGGTTGTCTGCCTCCCGGGAGCCCCAGGGTGCCCAGGCGGGCCTCAGCTGAGTCCAGGCCTCGGGGACAGTCCGTGCACGCTCCTGGGGCTGGGGGCGGGCACTTGTCCCAGCCACGTTTCTGCTGACTGAGCAGCCTTCTTCATGAGCTCACGCCTTTCCAGAGAAATCCCTTAATGCCGCCATTCTGCTGGTGGCATATATAGGGAGGGCTCGGCCTTGGCTCCACACTGGCTGCCAGAGGCCCCGCTGACTCCTGCCAGCCTCCAGGTCCCCGTGGTACCAAAGCTGAACATGGACGTG
Start End Score Promoter Sequence
711 761 0.96 TCGCGCCACTATATGATCTGGGCGCCACTCTGGGTGACACAGCAAGACTC
1388 1438 0.87 AACCTCTGTGTCTAACGGGGGTGTGTGCTCTCCCTCCTCTGGCGACCATG
1755 1805 1.00 GCTGGTGGCATATATAGGGAGGGCTCGGCCTTGGCTCCACACTGGCTGCC

5、对下面序列进行六框翻译，利用GENESCAN综合分析(首先确定给定序列的物种来源)哪个ORF是正确的，输出六框翻译（抓图）和GENESCAN结果(包括predicted genes/exons 和 predicted peptide sequence(s) 两个部分)
先blast
进入ncbi打开ORF finder 粘贴入序列〉！！！在Genetic codes选择第一个standard!!!!（一定有这个）点orfFind@图@ 搜索GENESCAN进入 粘贴序列后点run GENESCAN
物种来源为人类 +1的开放阅读框为正确
。
CTCGCGCAGGGGGGGTCGCCTGAGATCACAGAGACAATGGTGAAGGCAGTTGCTGTCCTCGCCGGCACTGATGTCAAGGGCACCATCTTCTTTTCACAGGAAGGGGATGGTCCGACCACCGTGACTGGAAGTATCTCTGGCCTCAAGCCAGGCCTCCATGGGTTCCATGTGCACGCGCTTGGCGACACCACCAACGGCTGCATGTCGACTGGGCCACACTTCAATCCTGTTGGCAAGGAGCATGGTGCACCGGAAGATGAGGACCGCCATGCCGGTGATCTTGGGAATGTGACAGCGGGAGAAGATGGTGTTGTTAATGTCAATATTACTGACAGCCAGATACCTCTTGCTGGACCCCACTCGATCATTGGCCGAGCTGTTGTTGTCCATGCTGATCCGGATGACCTTGGCAAAGGTGGACATGAGCTTAGCAAGAGCACCGGAAATGCTGGCGGACGTGTTGCCTGTGGTATCATTGGGCTCCAAGGCTAAAGCGGTTAACCTCCGAGGCAAACACCATAGAAGATCGAAGCGAGCACCTCAGGATGTTGCTGTTCCATTTCCCTGTATTGGCAACACAATTTGAGTACTCCAAATAAGCGCCTGATCCATGATCAGAGAGCACTATCATGCATTTGTATATATGAACAATGTTGCGCACCTGCTTAAGTGTCTGTTCCAACAAATGCTTAAG

6、进入REBASE限制性内切酶数据库，输出AluI、MboI、EcoI三种内酶的Recognition Sequence和Type。
搜索rebase，在Or go directly to enzyme name or #: 下的框内输入酶名称后点go

Recognition Sequence type
AluI AG^CT Type II restriction enzyme
MboI ^GATC Type II restriction enzyme
EcoI GAT Putative Orphan methyltransferase
7、使用引物设计工具，针对下列未知序列设计一对引物，要求引物长度为20-25bp，扩增产物长度300-500bp，退火温度为50-60℃。请写出选择的一对引物（Forward Primer and Reverse Primer）、及相应的GC含量、引物的位点、Tm值和产物长度。

GTTTTGCACCTTCGTTTCCTGCGGCGGCTTCTGTCGTCTCCTTGCTTTTTGCTCTCCCAGGTTCCGAGGCCGCCGCGCGTCTCCCGGGGAAGCATGGCGATGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGTCCGGTGCAGGGCGTCATTCACTTCGAGCAGAAGGCAAGCGGTGAACCAGTTGTGGTGTCAGGACAGATTACAGGATTAACTGAAGGCGAGCATGGGTTCCATGTCCATCAATATGGGGACAATACACAAGGCTGTACCACTGCAGGACCTCATTTTAATCCTCACTCTAAGAAACATGGCGGTCCAGCGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACCTGGGCAATGTGGCTGCTGGAAAGGACGGTGTGGCCAATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGATCTCACTCTCAGGAGAGCATTCCATCATTGGCCGTACTATGGTGGTCCACGAGAAACAAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACTGGAAATGCTGGAAGCCGCTTGGCTTGTGGTGTGATTGGGATTGCCCAATAAACATTCCCTATGTGGTCTGAGTCTCAGACTCATCTGCTGTCCTGCTAAACTGTAGAAAAAAACCAAACCATTAAACTGTAATCTTAACAGTT
8、将下面的序列用NEBcutter 2.0工具分析，用产生平末端及有四个酶切位点的酶进行酶切，并用抓图提交胶图（view gel），要求1.4% agarose和Marker为100bp DNA Ladder。
进入google首页，搜索NEBcutter 2.0，进入主页！粘贴入序列 选择custom digest，选择Enzymes cutting N times]，填4个，选出平末端的-----digest View gel。选择1.4% agarose和Marker为100bp

CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAGCCGAGCCACATCGCTCAGACACCATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTCAACTACATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGGGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGACCCCTGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCTCACTGCTGGGGAGTCCCTGCCACACTCAGTCCCCCACCACACTGAATCTCCCCTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCCTTGAAGAGGGGAGGGGCCTAGGGAGCCGCACCTTGTCATGTACCATCAATAAAGTACCCTGTGCTCAACC
9、对下面序列进行六框翻译，利用GENESCAN 综合分析哪个ORF是正确的，输出正确的ORF六框翻译（抓图）和GENESCAN结果(包括predicted genes/exons 和 predicted peptide sequence(s) 两个部分)。并针对正确的ORF设计一对引物，输出引物即可。另对序列进行酶切，且在正确的ORF区域的两侧选择有两个酶切位点的限制性内切酶进行分析，输出默认的胶图（view gel）要求1.4% agarose和Marker为100bp DNA Ladder。
进入orffinder 贴入序列 因为从fasta格式的特性中看出是人类 genetic codes 选择2 vertebrate mitochondrial orfind 得出@六图@进入genescan得到@图@
所以选择232到696bp在六框翻译上最近似的
+3 是正确的
进入genefisher 选择产物长度大于465 选择在232 到696bp间的 若找不到 可放宽限制条件
进入nebcutter 选择balf

+3正确

>gi|48762945|ref|NM_000454.4| Homo sapiens superoxide dismutase 1, soluble (amyotrophic lateral sclerosis 1 (adult)) (SOD1), mRNA
GTTTGGGGCCAGAGTGGGCGAGGCGCGGAGGTCTGGCCTATAAAGTAGTCGCGGAGACGGGGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTCCTGCAGCGTCTGGGGTTTCCGTTGCAGTCCTCGGAACCAGGACCTCGGCGTGGCCTAGCGAGTTATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAACATTCCCTTGGATGTAGTCTGAGGCCCCTTAACTCATCTGTTATCCTGCTAGCTGTAGAAATGTATCCTGATAAACATTAAACACTGTAATCTTAAAAGTGTAATTGTGTGACTTTTTCAGAGTTGCTTTAAAGTACCTGTAGTGAGAAACTGATTTATGATCACTTGGAAGATTTGTATAGTTTTATAAAACTCAGTTAAAATGTCTGTTTCAATGACCTGTATTTTGCCAGACTTAAATCACAGATGGGTATTAAACTTGTCAGAATTTCTTTGTCATTCAAGCCTGTGAATAAAAACCCTGTATGGCACTTATTATGAGGCTATTAAAAGAATCCAAATTCAAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAA