短小芽孢杆菌产亚麻脱胶酶系研究(含实验数据).doc

本科学生毕业论文
论文题目：
短小芽孢杆菌产亚麻脱胶酶系研究
学 院：
生命科学学院
年 级：
2012级
专 业：
生物工程
姓 名：
党振元
学 号：
20114545
指导教师：
宋刚

2015年 5月 3日

摘要

温水沤麻体系是一个复杂的生态系统，其脱胶实质是利用亚麻原茎上微生物产生的脱胶酶，包括果胶酶、甘露聚糖酶及多聚半乳糖醛酸酶等，降解果胶及半非纤维素类胶质物质，将亚麻纤维从非纤维类物质中分离出来。本研究以分离自温水沤麻液的短小芽孢杆菌为供试菌，考察该菌株在以胶质组分为唯一碳源的培养基中，产脱胶酶的组分和进程。
结果表明供试菌株在PEC培养基中48 h果胶酶活力最高为138.39±4.9 U/mL，在KF培养基中36 h的果胶酶活力最高118.08±6.8 U/mL。在两种培养基中，木聚糖酶活力变化趋势表现出一定的规律性，但是其总体数值并不高。供试菌株产生果胶酶、甘露聚糖酶及木聚糖酶，在亚麻纤维脱胶过程中具有潜在的应用价值。本研究成果为生物法沤麻提供了菌株来源，有助于亚麻脱胶机理的揭示，同时对温水沤麻技术的完善革新也有推动作用。

关键词

亚麻，短小芽孢杆菌，脱胶酶
II

Abstract

Water retting system is a complex ecosystem. The essence of degumming is that the degumming enzymes produced by microorganisms on the flax stem degrade pectin and semi-cellulose gummy substances to obtain bast fibers or fiber bundles. The degumming enzymes mainly include pectinase, mannase and polygalacturonic acid enzymes. This study isolated from warm water retting liquid shortness of B. pumillus was used for bacteria to examine the strain in the colloid group is divided into the only medium carbon source, producing enzyme degumming of components and processes.
Results revealed that B. pumillus can produce pectinase in PEC and KF. The highest activity of pectinase in PEC (48 h) was 138.39±4.9 U/mL, the highest activity of pectinase in KF (36 h) was 118.08±6.8 U/mL. In two kinds of culture medium, the xylanase activity trends show certain regularity, but its overall value is not high. Showed that all strains producing pectinase, mannase and xylanase, in the process of flax fiber degumming has potential application value. The achievements of this study would be helpful to reveal the degumming mechanism and improve industrial process of water retting of flax.

Keywords

Flax, Bacillus pumillus, Degummase

目录

摘要 I
Abstract II

1. 前言 4
1.1 亚麻概述 4
1.1.1 亚麻的种植历史与区域 4
1.1.2 亚麻原茎的结构 4
1.1.3 亚麻纤维的特性 5
1.2 亚麻脱胶研究进展 5
1.2.1脱胶的过程与原理 5
1.2.2 常用脱胶工艺 6
1.2.3 脱胶酶的类型与作用方式 8
1.3 本研究的目的与意义 10
2. 材料与方法 11
2.1 实验材料与仪器 11
2.1.1 供试菌株 11
2.1.2 培养基 11
2.1.3 主要试剂 11
2.1.4 主要仪器与设备 12
2.2 实验方法 12
2.2.1 供试菌株的活化与培养 12
2.2.2 果胶酶活性测定方法 12
2.2.3 甘露聚糖酶活性测定方法 13
2.2.4 木聚糖酶活性测定方法 13
2.2.5 供试菌生长量的测定 13
3. 结果与讨论 15
3.1 供试菌果胶酶活性动态变化 15
3.2 供试菌甘露聚糖酶活性动态变化 15
3.3 供试菌木聚糖酶活性动态变化 16
3.4 供试菌生长量动态变化 16
4. 结论 18
参考文献 19
致谢 21

IV

短小芽孢杆菌产亚麻脱胶酶系研究
1. 前言
1.1 亚麻概述
1.1.1 亚麻的种植历史与区域
亚麻是历史悠久的作物，一年生草本植物。按照其用途可以分为纤维用、榨油用和油纤兼用几种类型。人类种植和利用亚麻的历史有8000多年[1]。我国种植亚麻的历史有两千多年，有文献认为中国亚麻种植的历史要从张骞从西域归来后算起，张骞作为汉朝的特使从西域带回来产于西域的亚麻种子，也有学者对此表示怀疑。但是可以确定的是，亚麻在汉朝就已经有种植了。在1930年代在内蒙古西部出土的汉代遗址中有两枚木简上记载了胡麻[2]。这两枚木简上胡麻字样清晰可见，而这里的地理位置处于中国的西北，气候环境适合油料亚麻的种植，至今还是当地的主要油作物。由此可知木简上记录的“胡麻”就是现在的油用亚麻。在公元2世纪的《四民月令》中多出出现“胡麻”的字眼，作者催寔是当时的冀州人，也就是当今的河北安平一代，其活动区域在当今的河北、山西、内蒙古东南以及山东半岛一带[3]。现今这些区域仍有种植油用亚麻，且还用胡麻一词，由此可知催寔书中的“胡麻”就是当今的油用亚麻。古代对于亚麻的记载大多都是指油用亚麻。我国纤维亚麻的种植是从20世纪初开始的[4]。
现在，全球栽培纤维用亚麻的国家主要集中在北半球，其中大部分国家都位于在欧洲、主要有法国、比利时、奥地利、爱尔兰、土耳其、匈牙利、罗马尼亚俄罗斯等，北美洲和中国也是纤维用亚麻的主要生产地区。位于加拿大中部的马尼托巴是世界上产麻量最高的地区之一，其纤用亚麻由于质量与产量的双高而闻名世界。加拿大、法国、比利时的纤用亚麻产量世界领先，其中加拿大的纤用亚麻产量世界第一，产量超过世界总产量的百分之四十[5]。中国亚麻种植的区域较广，种植面积也较高，但是纤用亚麻的产量只排到世界第六位。我国纤用麻的主要产区有甘肃、新疆、湖南、云南、内蒙、浙江、吉林、辽宁、黑龙江等地。黑龙江的呼兰、兰西、延寿、克山、宝清等市县都有大范围的纤用亚麻的种植，尤其是兰西，各地区已经逐步形成了纤用亚麻产业链[6-7]。
1.1.2 亚麻原茎的结构
成熟的亚麻原茎表面覆盖着很厚的角质层，表皮上分布有大量气孔。韧皮部内分布着由不同数量的纤维细胞组成的纤维束，纤维细胞的两端尖锐，单纤维的长度约为20到30毫米，最长时可以达到100毫米左右。每个纤维细胞靠果胶质粘着在一起。纤维束之间分布着大量的韧皮薄壁细胞、筛管和其他细胞。韧皮部内测有形成层和木质部。
1.1.3 亚麻纤维的特性
亚麻纤维修长平直，在显微镜下观察，发现纤维纵向排布像竹子一样一节一节，没有棉花和羊毛纤维那样弯曲错乱。纤维表面纵向排布的条纹，在有些地方，这些条纹会横向地错位。纤维的横截面呈不规则的多角形状，中间有狭窄的空腔。
亚麻纤维柔韧、吸湿性好、散热速度快、手感舒适、防静电、防辐射、阻燃、能够抑菌保健，色泽也很柔和 [8]。
（一）散热性
用亚麻纤维所制成的纺织物被称为“天然空调”。亚麻的散热性极佳，透气比率达到百分之二十五以上，这是因为亚麻是所有天然的纤维中唯一一种束纤维，是由亚麻细胞通过胶质粘着在一起的，所以胞间空隙就非常小，没有多余的留有空气的空间，因而导致亚麻的透气性与导热性极佳，可以非常有效地降低皮肤温度[18]。
（二）吸湿散湿速度快
亚麻纤维的纺锤形结构和独有的果胶质斜边孔构造，使得亚麻纤维制成的纺织物吸湿散湿效果明显，同等质量的亚麻纤维能够吸收的水分是其他纺织纤维中最高的，达到自重的百分之二十。能够很好的调节人体表面的湿度环境。且当接触到皮肤时，会产生毛细孔现象，可协助皮肤排汗清洁皮肤[19]。同时，它遇热后会张开，吸收皮肤表面的热量与汗液，并均匀地传导出去，有效的为皮肤降温。预冷则关闭，有效地保存体温。
（三）保健性
科学考察发现，古代埃及法老的遗体都被包裹在大量密实严谨的亚麻细布内，在一定意义上减缓了尸体的腐烂，这得益于亚麻独特的抑菌杀虫效果。亚麻属于隐香科植物，能够散发出隐隐的芳香，专家认为，这种香味能够抑制并杀死多种细菌，并且还有惊人的驱虫效果。大量科学实验表明，亚麻有明显的抑菌效果。对于国际标准菌株白色念珠菌等的抑制率达到百分之六十五以上，对大肠杆菌和金色葡萄球菌的抑制率更是超过了百分之九十[9]。
1.2 亚麻脱胶研究进展
1.2.1脱胶的过程与原理
要使用亚麻纤维，就要先将亚麻纤维从亚麻原茎的韧皮部分离出来。在亚麻生产的过程中，脱胶是非常关键的一步，脱胶的过程直接影响生产周期与亚麻纤维制品的质量。在亚麻脱胶的工艺环节中，包含有复杂的化学物理变化。在脱胶的过程中，亚麻脱胶体系中的多种微生物会产生纤维素酶、果胶酶等多种酶类。这些酶促使亚麻纤维从周围的组织与附着物上分离下来。亚麻单个纤维的长度为十到二十六毫米，单个纤维顶端由果胶质粘黏搭接成束状的纤维束，原茎中的各种物质与组织都靠胶质粘在一起。要分离出可纺织纤维，务必要破坏纤维束与个个组织之间的粘着，使纤维从木质部分离下来，同时又要避免连接单个纤维之间的胶质的过分破坏，这个过程就是所谓的亚麻原茎脱胶[20-22]。
1.2.2 常用脱胶工艺
亚麻脱胶的工艺有很多种，大致可以分为化学脱胶、物理脱胶和生物脱胶三大类。化学法是使用化学物质通过化学反应溶解果胶，像亚麻的化学煮炼等方法都属于化学法。物理法是利用高压蒸汽水解果胶，像蒸汽法制干茎。生物法就是利用微生物多样性，通过微生物分解果胶达到脱胶的目的。生物脱胶法是目前世界上最先进最占主导地位的脱胶方法。
(一) 温水脱胶
温水脱胶法属于生物脱胶，先将亚麻原茎通过适当的等级分开选茎，分为不同的等级，对同一等的原料按照原茎的粗细与光泽等分开放置，然后将选好的原茎捆在一起，将捆好的原茎放入沤麻池内进行脱胶，常见的沤麻池大多为三十到五十立方米的钢筋水泥池。注入干警的水并加热至三十到三十二度，这个温度可以使微生物迅速繁衍起来，经过三到五天，果胶被分解，原茎中的纤维束大多已经从木质部脱离下来，沤麻池中的脱胶结束[23]。
温水脱胶可以生产出稳定高质量的麻纤维。不受外界条件的影响，脱胶时间短，沤麻场地面积小，空间利用率大是温水沤麻的最大优点。用这种方法获得的纤维俗称温水麻，颜色大体为黄色、深黄、黄绿等。
(二) 雨露脱胶
雨露脱胶法同样属于生物脱胶法的一种。这种脱胶方法是将获得的亚麻原茎平铺的平坦的地面上，通过阳光照射与雨露的作用，利用原本就有的微生物的生命活动破坏亚麻原茎中的胶质，使得亚麻原茎中的纤维束从木质部上面分离下来，完成脱胶。雨露脱胶由于是通过自然的天气与条件进行脱胶，所以其工艺工程受到阳光、水分、温度与地理条件等因素的制约。雨露脱胶所用微生物的最适繁殖温度为十八到三十度，脱胶所用时间为二十到三十天不等。最后得到的雨露麻的颜色大体为灰色与深灰。
这种脱胶方法的优点是不需要太多的设备，条件简易、成本低廉、易于实施。但是受到自然条件的影响比较大。由于我国自然环境多变，再加上最近几年雾霾泛滥，光照条件差，使得雨露脱胶的条件不理想，所以采用雨露脱胶获得的麻纤维质量比较差。
(三) 冷水脱胶
冷水脱胶同雨露条件一样对自然的条件的依耐较高，是一种生物脱胶法。利用各种水源，如湖泊、鱼塘、池塘、水库、积水池、河流等或人造水池进行脱胶，时间大致为七到二十五天左右。
冷水脱胶条件设施简易、生产成本低廉、易实施，但是受到自然条件、水质、天气、温度等的影响较大，脱胶过程不稳定，麻纤维质量差。
(四) 酶法脱胶
步入二十一世纪，伴随着科技水平的迅速发展，亚麻纤维脱胶已经深入到了分子水平，在脱胶工艺中酶的使用已经成为新的主导方向，这得益于生物技术的告诉发展。酶法脱胶就是培养脱胶微生物并且利用脱胶微生物产生的酶对亚麻原茎进行脱胶的技术，通常将脱胶微生物培养到菌株的衰老期后进行离心过滤，得到粗酶液，再用其浸渍原颈，也可以使粗酶液浓缩为药剂或者干燥成粉末状。要使用时，将其稀释或将粉末溶解入水中，将原颈在霉的作用下进行脱胶处理。
酶法脱胶的工艺流程如下:
制备菌种→扩大培养→配液←得到沤麻水→消化→排放
↓ ↑
原茎分级打捆→装池→接种→生物脱胶→晒麻→养生→制纤
这种沤麻方法提高了沤麻水的利用率，通过再利用使得其比传统的温水沤麻相比节省了三分之二的沤麻水。大大提高了生产的劳动效率，通过纯化的脱胶菌能在非常少的时间完成脱胶的工作，使得整个脱胶的周期缩短了超过百分之七十。大幅加快了生产周期与生产速度。
(五) 化学脱胶
这种方法是将亚麻原颈经过揉、压、挤之后置入弱的氢氧化钠溶液中浸泡，再经过几次的硫酸处理，使得原颈膨胀，再通过机械的方法使得亚麻纤维从原颈上剥离下来。整个的工艺为：浸入酸→用水洗→碱氧浴→打纤→用酸洗→再用水洗→加入膨松剂→浸泡→用水洗→原茎脱水→给油→脱油脱水→烘至干燥→机械切断→机械剥离。
由于化学脱胶使用了大量的酸碱和化学物质，使得纤维束的强力有所下降，影响了麻纤维的性能。
(六) 汽蒸脱胶
蒸汽脱胶是一种物理方法。工艺是，将亚麻原茎在冷水中炮至韧皮组织膨胀，大约一小时左右，同时去掉了一些水溶物质，然后将泡好的原茎移入到蒸汽锅，将锅中的压强控制在245kPa，保持七十五到九十分钟之后取出。
这种方法有很大的优点，在经济上也较为省钱，由于在水解果胶的途中基本没有使得纤维素被破坏，所以得到的纺织纤维质量良好。
1.2.3 脱胶酶的类型与作用方式
亚麻纤维纺织成的产品在世界的每个角落备受亲睐，国内外市场前景巨大。要保证亚麻纤维产品的质量，做好纤维脱胶就显得格外重要，因为脱胶的工艺过程直接影响产品的好坏[26]。然而，整个脱胶过程是一个十分复杂的生化过程，在整个工艺环节中，应用于亚麻脱胶体系中的脱胶菌就会分泌各种酶类，像纤维素酶、果胶酶等等，这几种酶综合作用使得亚麻原茎中的果胶质、半纤维素和木质层等纺织不需要的物质一定程度地分解。亚麻脱胶体系中的重要酶类有果胶酶和甘露聚糖酶，这两种酶分别水解果胶和半纤维素。接下来，让我们来详细的对这两种酶进行介绍。
(一) 果胶酶
果胶是一种普遍存在于植物细胞的细胞壁与细胞中间片层的复杂胶体性多糖物质[10]，法国人Bracennot在公元1824年从胡萝卜中第一次提取到，并且以“pectin”为其命名[11]。果胶是D-吡喃半乳糖醛酸通过α-1,4糖苷键链接起来的多糖，分子量为50-300Kd,呈酸性。除了吡喃D-半乳糖醛酸之外，果胶中还包含有微量的中性糖，像L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖等，也有多达十二种的单糖，例如D-甘露糖、L-岩藻糖等[12]。常见的果胶填充在细胞与细胞壁的空隙中，使得细胞聚集在一起。亚麻原茎中的纤维束就是由果胶粘结在一起的，所以，果胶的去除是脱胶的首要目标之一[13]。
果胶酶是一类可以催化分解果胶的多种酶的总称，是生物催化剂。果胶酶作用于果胶使其分解成小分子的半乳糖醛酸等。果胶酯酶和解聚酶是果胶酶的两个大类[14]。脱胶初期时，亚麻原茎的韧皮部果胶先被水解，使得内部的班纤维素也显露出来，使得半纤维素产菌的产酶活力上升。随着半纤维素的降解，果胶的暴露面积增大，果胶酶与果胶的接触面积增大，使得果胶的分解速度加快。到了脱胶末期，随着脱胶环境中产果胶酶的菌群代谢物的增加，加之果胶的大量消耗，果胶酶的活性越来越低。整个的脱胶过程中，果胶酶起主导作用，半纤维素由于增大了果胶酶与果胶的接触面积，起到了一定的促进作用。整个脱胶过程使得胶质纤维束逐渐分离开来。
(二) 甘露聚糖酶
在脱胶的过程中，除了果胶之外还有大量的半纤维素需要去除，半纤维素包含有甘露聚糖、多聚半乳糖和木聚糖等，结构非常复杂。半纤维素的讲解在原茎的脱胶中也是至关重要的组成[25]。
甘露聚糖是通过1,4-β-D-甘露糖甘键连接成的一种多糖。广泛存在于生物体的甘露聚糖酶主要作为胞外诱导酶。也以结构酶的形式存在于某些少量的微生物中。本次讨论的甘露聚糖酶为β-甘露聚糖酶，这种酶内切水解酶水解l,4-β-D-毗喃甘露糖的主链，是一种半纤维素水解酶。能够水解高聚糖分子，包括半纤维素在内的葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和甘露聚糖等[15]。
与木聚糖酶和果胶酶等酶协同作用，能够达到理想的生物脱胶效果。这种酶现在已经被广泛应用在各种工业如造纸、食品、医药、纺织、印染等[16]。
1.2.4亚麻脱胶工艺中应用的脱胶菌株
部分科学工作者从浸渍过的亚麻原茎上分离出了多种脱胶细菌，并把这些细菌分为好需氧型和厌氧型。
已经分离得到的需氧型超过数十种，有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微球菌属(Micrococcus)等的一些种。Delavel与Kayser通过分离获得五种能用来脱胶的菌种。黄麻芽孢杆菌(Bacillus corchorus)的脱胶能力较强，是Makahama与Katagiri分离得到的。Rossi分离到的柯氏芽孢杆菌(Bacillus comesii Rossi)脱胶能力也很出色。Debsarma自黄麻的浸渍液中分离到三个种的脱胶菌，共8株。中科院麻类研究所得到的枯草芽胞杆菌T66对苎麻有很强的脱胶能力。厌氧型，像嗜果胶颗粒状杆菌(Granulobacter Pectinovorum)等。Tobler与Carbone在1922年从大麻的浸渍液里得到费地芽孢梭菌（Clostridium felsineus）。英国人从亚麻的浸渍池发现了第三芽孢梭菌（Clostridium terlium）。Hellinger从浸渍过的亚麻中找到了金黄丁酸芽孢梭菌(Clostridum anranlibutyricum)。Weizmann从亚麻分离出果胶芽孢梭菌(Clostridium pectinovorum)。随着各类菌株的发现，贝氏芽孢梭菌(Clostridium beijerinckii)、嗜果胶芽孢梭菌(Clostridium pectinovorum var pseudoplectriforme)变种等也被陆续发现。季鸣时等人从沤麻池得到编号19的厌氧芽孢杆菌[17]。
随着亚麻脱胶技术的深入研究与应用，会有越来越多的越秀脱胶菌株被发掘与利用，为纤用亚麻产业的高速发展做好基石。
1.3 本研究的目的与意义
通过本文对亚麻纺织业的各种介绍与讨论可以发现，依耐生物技术的生物脱胶已经成为亚麻脱胶的新发展趋势，理想的脱胶菌株应不产破坏亚麻纤维质量的纤维素酶而能够很高效地除去胶质。新的优秀菌株的开发已经成为了亟待解决的问题。
本研究以分离自温水沤麻液的短小芽孢杆菌为供试菌，考察该菌株在以胶质组分为唯一碳源的培养基中，产脱胶酶的组分和进程。本研究成果为生物法沤麻提供了菌株来源，有助于推动生物沤麻的技术革新。同时该研究也希望能够为亚麻纺织业的新模式与发展做出微薄贡献。
2. 材料与方法
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 供试菌株
短小芽胞杆菌（Bacillus pumillus）保藏于黑龙江大学生命科学学院省高校微生物重点实验室，用于粗酶液的制备。
2.1.2 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（BP）
牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0-7.2，121 °C灭菌15 min，用于供试菌株活化、复壮及菌种保藏。
（2）果胶发酵产酶培养基（PEC）
果胶 10 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，蒸馏水1000 mL，115 °C灭菌20 min，用于发酵产脱胶酶。
（3）魔芋粉发酵产酶培养基（KF）
魔芋粉20 g，酵母膏5 g，NaNO3 5 g，K2HPO4 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121 °C灭菌20 min，用于发酵产脱胶酶。
2.1.3 主要试剂
（1）pH 4.0 磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液
准确称取1.05 g柠檬酸晶体，蒸馏水溶解并定容至50 mL，即为a液；准确称取3.58 g Na2HPO4·12H2O晶体，蒸馏水溶解并定容至50 mL，即为b液；用两支移液管分别吸取a、b两种溶液12 mL、8 mL，混合均匀后，再用a溶液调节缓冲液pH值至4.0。
（2）pH 6.8 磷酸盐缓冲液
准确称取3.58 g Na2HPO4·12H2O晶体，蒸馏水溶解并定容至50 mL，即为a液；准确称取1.56 g NaH2PO4·2H2O 晶体，蒸馏水溶解并定容至50 mL，即为b液；分别取a液49 mL和b液51 mL，均匀混合后，用pH计矫正。
（3）0.25%果胶溶液（m/v）
准确称取果胶粉0.25 g，用适量磷酸盐缓冲液（pH 6.8）溶解，定容至100 mL。
（4）0.5%魔芋粉溶液（m/v）
准确称取去还原糖魔芋粉0.5 g，用适量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 4.0）溶解，并定容至100 mL。
（5）0.1%多聚半乳糖醛酸溶液（m/v）
准确称取多聚半乳糖醛酸0.1 g，用适量的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，0.05mM CaCl2）溶解，并定容至100 mL。
（6）DNS试剂
准确称取苯酚6.9 g，溶于15.2 mL 10%NaOH溶液中，用蒸馏水稀释至69 mL，然后加入6.9 g亚硫酸氢钠，即为a液；称取DNS 8.8 g，充分溶解于880 mL蒸馏水中，即为b液；称取酒石酸钾钠225 g，充分溶解于300 mL 10% NaOH溶液后，加入b溶液中，即为c液；将a与c溶液混合，即为黄色DNS试剂，贮存于小口棕色瓶中，在室温下放置7-10天后使用，有效期一年。
（7）0.9%生理盐水
准确称取NaCl 0.9 g，用适量蒸馏水溶解，并定容至100 mL。
2.1.4 主要仪器与设备
本研究中使用的主要仪器设备如表2-1所示。
表2-1 本研究中使用的主要仪器设备
仪器名称及型号
厂家
Air TECH 超净台
苏净集团安太公司
蒸汽压力灭菌锅
日本三洋电子有限公司
TGL-16G高速台式离心机
上海安亭科学仪器厂
HZQ-QX摇床
哈东联电子技术开发公司
MILLIQ-AMILLIPORE超纯水纯化系统
密理博中国有限公司
Mettler pH Meter；
梅特勒-托利多公司
752型紫外可见分光光度计
上海光谱仪器有限公司
SK-1快速混匀器
常州国华电器有限公司
FEB-85恒温电磁搅拌器
常州国华电器有限公司
DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱
上海精宏实验设备有限公司
2.2 实验方法
2.2.1 供试菌株的活化与培养
将甘油管保藏菌株B. pumillus和E. coli DH5α按1%（v/v）的接种量，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，其装液量为20 mL/50 mL。然后，将其置于37 °C，160 r/min振荡培养12 h；获取发酵液，进行多次平板划线分离纯化，镜检。将分离纯化后的菌株用于菌株斜面保藏（4 °C）。
2.2.2 果胶酶活性测定方法
在25 mL具塞比色管中，分别加入0.5 mL粗酶液和0.5 mL 0.25% （w/v） 果胶溶液（用pH 6.8磷酸缓冲液配制）。在50 °C下保温30 min。加入2 mL DNS试剂，在沸水中煮沸5 min，冷却后加水定容至20 mL。充分混匀后在波长540 nm下测出OD550值并计算出还原糖含量（mg/mL，以半乳糖醛酸计）。对照采用酶失活的方法处理：先在25 mL比色管中加入粗酶液，沸水浴5 min使酶失去活性，再加底物溶液，其余步骤与试验组相同。在上述条件下，将每小时内每毫升果胶酶催化果胶生成1μg还原糖（以半乳糖醛酸计）所需的酶量定义为一个酶活单位。
由上面所得回归方程及葡萄糖和半乳糖醛酸之间的换算关系，可以计算发酵液中还原糖的含量的公式及发酵液酶活力公式：

2.2.3 甘露聚糖酶活性测定方法
在25 mL具塞比色管中，加入0.1 mL粗酶液和0.9 mL 0.5% （w/v）去除还原糖的魔芋粉溶液（使用75%的乙醇按5:1（mL:g）浸提数次，直至无还原糖成分；用pH 4.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制）。在55 °C下保温30 min。加入3 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后加水定容至25 mL。混匀后在波长550 nm下测OD550值并计算出还原糖含量（mg/mL，以甘露糖计）。对照采用酶失活的方法处理：先在25 mL比色管中加入粗酶液，沸水浴5 min使酶失去活性，再加底物溶液，其余步骤与试验组相同。在上述条件下，一个酶活力单位定义为每分钟产生相当于1 μmoL D-甘露糖的酶量。
按照下式计算β-甘露聚糖酶活力：

2.2.4 木聚糖酶活性测定方法
在比色试管中加入0.5 mL粗酶液和0.5 mL 0.1%的木聚糖底物（pH值5.0；磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液配制），然后加入0.5 mL酶液，在50°C下准确反应30 min，加入3.0 mL的DNS溶液并立即放入沸水浴保温5 min进行显色反应，冷却后补蒸馏水至25 mL，在490 nm下测定OD值并计算木糖含量（mg/mL）。以对照组同样采用酶失活方式。酶活定义：在上述条件下，每分钟水解木聚糖生成1 mg木糖为一个酶活力单位，以U/mL表示。

2.2.5 供试菌生长量的测定
在无菌的条件下，将上述获得的种子液用培养基将菌体浓度调至对数期1.0×108 cell/mL，以2%（v/v）的接种量，分别接种于果胶发酵产酶培养基（PEC）、魔芋粉发酵产酶培养基（KF）中，其装液量为200 mL/500 mL。然后，置于37 °C，160 r/min条件下，振荡培养72 h。每间隔6 h，取适量的发酵液，分别测定供试菌株的OD600和总菌数（血球计数板测定），绘制供试菌株生长曲线。

11

短小芽孢杆菌产亚麻脱胶酶系研究

3. 结果与讨论
3.1 供试菌果胶酶活性动态变化

图3-1供试菌在PEC中果胶酶动态变化

图3-2供试菌在KF中果胶酶动态变化
图3-1、3-2为供试菌产果胶酶变化趋势，在KF培养基中0-24 h处于微生物生长延滞期果胶酶活力较低。随着脱胶反应的进行，脱胶菌大量繁殖分泌胞外酶，体系中果胶酶活力逐渐升高。在PEC培养基中48 h酶活力最高为138.39±4.9 U/mL，在KF培养基中36 h的果胶酶活力最高118.08±6.8 U/mL。
3.2 供试菌甘露聚糖酶活性动态变化

图3-3供试菌在PEC中甘露聚糖酶动态变化

图3-4供试菌在KF中甘露聚糖酶动态变化
供试菌株在不同培养基质中产甘露聚糖酶酶进程如图3-3、3-4所示。当供试菌株在上述两种培养基中发酵至36 h和72 h时，甘露聚糖酶活力达到最大值，分别为237.4±2.1 U/mL和241.7±2.1 U/mL。由于甘露聚糖酶是一种胞外诱导酶[24]，其诱导机制的开启取决于外界营养物质的变化。当发酵培养基中易于吸收的营养物质耗尽时，供试菌株就处于一种“饥饿”状态，诱导机制就会被启动，产生诱导酶-甘露聚糖酶。如此反复，使甘露聚糖酶活力的变化趋势呈现出“锯齿”形。
随着发酵时间的延长，在发酵72-96 h时甘露聚糖酶活力也因底物的减少及用于菌体本身生长代谢的还原糖量的增多而开始下降。
3.3 供试菌木聚糖酶活性动态变化

图3-5供试菌在PEC中木聚糖酶动态变化

图3-6供试菌在KF中木聚糖酶动态变化
供试菌株在不同培养基中产木聚糖酶进程如图3-5、3-6。在两种培养基中，木聚糖酶活力变化趋势表现出一定的规律性，但是其总体数值并不高，酶活力最大值分别为407.4±2.1 U/mL和462.7±2.1 U/mL。因此，该数据表明供试菌株产生一定量木聚糖酶，在亚麻纤维脱胶过程中具有潜在的应用价值。
3.4 供试菌生长量动态变化

图3-7供试菌株在PEC培养基中的生长趋势

图3-8供试菌株在KF培养基中的生长趋势
供试菌株在不同培养基质中生长情况如图3-7、3-8。在PEC培养基中，供试菌株表现出先上升后下降的趋向。在6-24 h发酵期间，菌体生长趋向整体呈指数生长，菌体密度增长较快。在24 h时，菌体密度达到最大值，为4.78×109 cell/mL。之后，因为培养基内小分子类还原糖物质的消耗和有害次级代谢产物的增多，导致供试菌株在36-96 h发酵期间，菌体自身代谢活性下降，生长迟缓甚至发生自溶。
在KF培养基中，供试菌株的整体生长走势向后延迟，6-18 h是菌体生长的延迟期，其菌体密度在36 h达到最大值，为7.77×109 cell/mL。随着发酵进行，菌体密度逐渐下降。

4. 结论

本研究获得如下主要结论：
1. 短小芽孢杆菌在魔芋粉培养基中比在果胶培养基中生长状况要好，说明魔芋粉更易于菌株的利用。
2. 短小芽孢杆菌可以产生果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶，可用于亚麻脱胶的优良菌株。
3. 供试菌株在果胶酶和甘露聚糖酶这两种酶系上表现出显著的差异和突出的优势，使得该供试菌株在亚麻生物脱胶过程中具有深远的影响及潜在的应用价值。
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