蛋白染色法测定蛋白改性纤维蛋白含量的可行性研究.pdf

蛋白改性纤维作为改性纤维中的一类，在纺织终端产品中的应用越来越多，而作为添加成分的各类蛋白在经过纺丝、织造、前处理、染色、印花和后整理等诸多工艺流程尤其是酸、碱、高温等环境条件后，在纤维中的最终含量将决定产品的最终性能和价值。纺织行业现有蛋白改性纤维蛋白含量检测方法主要有FZ/T 500182013 蛋白粘胶纤维蛋白质含量试验方法（凯氏定氮法和次氯酸钠法）和 FZ/T540282010 蛋白质粘胶短纤维 附录A中规定的方法（凯氏定氮法）。两种方法既有优点也有局限性，凯氏定氮法通过一系列化学反应测定氮元素含量来反推蛋白质含量；但如果改性纤维本身含有氮元素则不一定适用，或者纺织品的其他成分含有氮元素，如腈纶、锦纶、氨纶和动物纤维，则通常需要将此类纤维通过拆分或溶解等手段先将其去除。如果添加的蛋白质在加工过程中已经发生分解，如分解为小分蛋白染色法测定蛋白改性纤维蛋白含量的可行性研究摘要：在分析现有含蛋白改性纤维产品蛋白含量检测方法的基础上，利用蛋白染色方法检测蛋白含量，分析了影响测试结果的各类因素。结果表明，酸、碱、有机溶剂等不适宜作为萃取试剂来进行蛋白提取；低浓度盐适宜用作萃取试剂，萃取条件为：室温、振荡萃取30 min、变色反应时间5 min。使用蛋白染色法测试含蛋白改性纤维产品蛋白含量操作简单，具有可行性。关键词：蛋白染色法；蛋白改性纤维；蛋白含量中图分类号:TS107文献标志码:C文章编号:1005-9350（2023）09-0049-04Abstract:Based on the analysis of the existing protein content determination methods of protein modified fiberproducts,the protein staining method is proposed to determinate protein content,and various factors affecting the test results are analyzed.The results show that acid,alkali and organic solvent are not suitable as extraction reagents for proteinextraction,while low concentration salt is suitable as extraction reagents.The extraction conditions are:room temperature,oscillation extraction 30 min,discoloration reaction time 5 min.The protein staining method is simple and feasible to measure the protein content of protein modified fiber products.Key words:protein staining method;protein modified fiber;protein contentFeasibility study on the determination of protein content ofprotein modified fibre by protein staining method收稿日期：2022-10-28作者简介：贺志鹏（1987），男，高级工程师，硕士，研究方向为检测技术标准化及纺织产业发展，邮箱：。贺志鹏1，2，刘亮3，朱林园2，王楷艳31.中国纺织信息中心，北京100020；2.中联品检（北京）技术集团有限公司，北京100025；3.苏州中纺联检验技术服务有限公司，江苏苏州215200HE Zhipeng1,2,LIU Liang3,ZHU Linyuan2,WANG Kaiyan31.China Textile Information Center,Beijing 100020,China;2.United Testing Service(Beijing)Co.Ltd.,Beijing 100025,China;3.United Testing Services(Suzhou)Co.Ltd.,Suzhou 215200,China染整技术Textile Dyeing and Finishing JournalVol.45 No.9Sep.2023第45卷第9期2023年9月染整技术45卷子链的肽链或是氨基酸基础单元，则测试结果并非实际存在的蛋白质，会产生严重的偏差。此外，染料中也通常有偶氮键、硝基、氨基等，其是否会对测试结果有影响，也需要进一步的研究。次氯酸钠法则是通过将蛋白质溶解后计算纤维质量损失来测得蛋白含量，但如果纤维本身容易被次氯酸钠溶解，或者纺织品的其他成分容易被次氯酸钠溶解则不适用。为了找到更简单、通用的含蛋白改性纤维纺织品中蛋白含量的测试方法，本试验借鉴食品行业常用蛋白染色法来研究测定纺织品蛋白含量的可行性。1试验1.1试剂与样品三级水（符合 GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法），20 g/L氢氧化钠溶液，0.1 mol/L氯化钠溶液，0.1 mol/L硫酸钠溶液。考马斯亮蓝染色溶液：精确称取100.0 mg考马斯亮蓝 G-250（分析纯），加入 95%乙醇溶液 50 mL，再加入质量分数为85%的磷酸100 mL，最后以三级水定容至1 L容量瓶中，溶液过滤后备用。蛋白标准溶液：称取牛血清白蛋白标准品10.2 mg（CAS号：9048-46-8，河南北方伟业计量技术有限公司），以三级水定容至100 mL，于低温环境保存备用。样品：蛋白改性黏胶纤维（广东兆天纺织科技有限公司）。1.2仪器天平（称量精度为0.000 1 g），分光光度计（波长为400800 nm，吸光度精确至0.001），恒温水浴振荡器，移液枪（最小刻度0.01 mL），中速定性滤纸（符合GB/T 19142017 化学分析滤纸 的规定）。1.3原理考马斯亮蓝 G-250 在游离态呈红色，与蛋白质的疏水区结合后变为蓝色，前者最大光吸收波长在465 nm，后者在 595 nm。蛋白质-染料结合物在 595nm的吸光度与蛋白质含量成正比。测定样品蛋白提取液与考马斯亮蓝 G-250 染色溶液反应后的吸光度，对照牛血清白蛋白标准工作曲线，计算样品中蛋白质的含量。1.4蛋白染色精确移取 0.45 mL 蛋白标准溶液于多个带刻度量具中，分别加入5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，再加入一定量三级水使最终体积为6.0 mL，混匀，依次静置不同时间，使用分光光度计，以1.0 mL三级水+5.0mL染料溶液为空白，在595 nm波长处测定吸光度。1.5标准溶液的配制分别精确移取蛋白标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5个带刻度量具中，各加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液，再分别加入一定量三级水使最终体积为6.0mL，混匀，静置 5 min，以 1.0 mL三级水+5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液为空白对照，测定595 nm处的吸光度。以蛋白质量浓度 m（g/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2结果与讨论2.1蛋白染色条件的确定影响蛋白质染色的条件主要有静置时间、pH。静置不同时间后的吸光度见表1。由表1可以看出，随着静置时间的延长，吸光度的变化幅度较小，考虑测试时间成本，综合现有文献，将静置时间定为5 min。考马斯亮蓝染料溶液以 85%的磷酸配制，显色溶液的pH基本为1.2左右。如果对pH进行调节，在不放大定容体积的前提下需要使用较高浓度的碱溶液，碱溶液的存在会对蛋白标准品造成影响，因此不进行pH的调节。2.2标准曲线的绘制每个质量浓度蛋白标准溶液制作两个平行样，并分为两组。第一组静置后，每个质量浓度分别测定3次吸光度；第二组静置 5 min后继续放置 2 h，再分别测定3次吸光度，结果见表2和表3。静置时间/min3.05.07.09.0吸光度0.3760.3780.3760.383静置时间/min11.013.015.020.0吸光度0.3850.3860.3830.379表1静置不同时间后的吸光度体积/mL蛋白标准溶液0.20.40.60.81.0考马斯亮蓝染色溶液55555三级水0.80.60.40.20.0对应蛋白质量浓度/（gmL-1）3.336.6710.0013.3316.67吸光度A10.1840.3460.4820.5510.707A20.1840.3270.4500.5400.625A30.1450.2750.3650.4290.547表2第一组吸光度测试结果509期分别按照上述 3 次吸光度单次测试结果以及 3次测试结果的平均值绘制标准曲线，并进行线性拟合，结果见表4。分析两组不同时间段的标准曲线发现，同一组、同一时间段的单次测试曲线线性均有所差别。第二组放置时间长，相关系数有所降低，但使用3次吸光度的平均值进行标准曲线绘制，相关系数仍然较好；同时，对于同一样品吸光度的测试结果使用不同标准曲线会有偏差，因此在进行批次样品试验时建议进行3次吸光度测试，使用其平均值绘制标准曲线。所测吸光度若有异常数据，应去掉异常数据并加测；数据全部异常，则应重新测试或删除该质量浓度点。考虑影响蛋白质稳定性的因素众多，在配制好标准溶液后，宜尽快完成标准曲线的绘制，确保结果的准确性。同时建议，在试验过程中，若进行标准曲线绘制及样品测试时试剂不足，应全部使用重新配制的溶液进行测试1。此外，如果使用标准曲线计算结果出现负值，应增加标准曲线绘制点，并降低质量浓度重新绘制。体积/mL蛋白标准溶液0.20.40.60.81.0考马斯亮蓝染色溶液55555三级水0.80.60.40.20对应蛋白质量浓度/（gmL-1）3.336.6710.0013.3316.67吸光度B10.3040.4680.5770.6320.767B20.1910.3580.3770.4870.610B30.1890.3130.4500.5750.619表3第二组吸光度测试结果使用数据A1A2A3A1、A2、A3平均值线性拟合方程y=0.037 5x+0.078 8y=0.032 8x+0.096 8y=0.028 7x+0.064 8y=0.033 0 x+0.080 1相关系数R20.985 80.986 60.988 80.989 4使用数据B1B2B3B1、B2、B3平均值线性拟合方程y=0.032 7x+0.222 6y=0.029x+0.114 5y=0.033 7x+0.092 7y=0.031 8x+0.143 3相关系数R20.975 70.958 90.976 40.989 8表4标准曲线的线性拟合2.3不同萃取溶剂对结果的影响分别移取 10%磷酸溶液、95%乙醇溶液、10 g/L氢氧化钠溶液、0.1 mol/L氯化钠溶液和0.1 mol/L硫酸钠溶液各 50 mL，均加入样品 1.0 g，室温振荡 30 min后，取上述各溶液1.0 mL，加入5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min。试验发现，10%磷酸溶液萃取后样液并未发生显色反应；95%乙醇溶液萃取后样液未发生蓝色变色反应，而是发生了图1a的变色，其余均发生了蓝色变色反应，如图1b所示。由此证明前两种溶剂是否提取到样品中的蛋白为未知，后3种溶剂均提取到样品中的蛋白。鉴于上述结果，分别移取10%磷酸溶液、95%乙醇溶液 0.6 mL，均加入 0.4 mL 蛋白标准溶液，加入5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min。试验结果与样液显色结果一致，表明10%磷酸溶液和95%乙醇溶液不适合进行蛋白染色法试验，考马斯亮蓝染液配方是固定的，在变色过程中不可以再额外加入其他酸性溶剂。为了消除酸性溶液对显色的影响，移取 1.0 mL10%磷酸溶液萃取的样液，依次加入 0.5 mL 氢氧化钠溶液、5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min，发a 95%乙醇提取样液b考马斯亮蓝染色溶液（左），加入蛋白标准溶液（右）图1不同萃取溶剂的显色反应贺志鹏，等：蛋白染色法测定蛋白改性纤维蛋白含量的可行性研究51染整技术45卷生蓝色变色反应。但试验发现，在考马斯亮蓝染色溶液中加入氢氧化钠溶液，未加入其他任何溶剂的情况下，染色溶液会发生蓝色变色反应，因此酸性和碱性试剂均不适合作为纺织品中蛋白的萃取试剂。考马斯亮蓝染色溶液中单独加入氯化钠和硫酸钠溶液未发生蓝色变色反应，因此认为是合适的，且低溶度盐对蛋白质具有盐溶作用，可最大程度萃取纺织品中的蛋白。分别移取 0.1 mol/L氯化钠溶液和0.1 mol/L硫酸钠溶液各0.6 mL，均分别依次加入0.4mL蛋白标准溶液、5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min后，在595 nm处测试吸光度，结果见表5。由表5数据得到标准曲线为 y=0.040 7x+0.084 9，R2=0.9939，表明使用氯化钠溶液后，测试结果更接近实际值。试剂氯化钠硫酸钠体积/mL0.60.6标准蛋白溶液体积/mL0.40.4标准蛋白溶液质量浓度/（gmL-1）6.806.80考马斯亮蓝染色溶液体积/mL5.05.0吸光度0.3600.380根据测试结果利用标准曲线反推蛋白质量浓度/（gmL-1）6.767.25表5使用氯化钠和硫酸钠溶液萃取测试结果2.4振荡时间的确定精确称取4份各1.0 g试样，分别置于250 mL锥形瓶中，各加入50 mL 0.1 mol/L氯化钠溶液，常温分别振荡10、20、30和60 min后，分别移取1.0 mL样液，依次加入5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min，在595 nm处测定吸光度，结果见表6。由表6可知，振荡30 min后吸光度最大。2.5样品测试及方法精密度精确称取 1.0 g 试样，置于 250 mL 锥形瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L氯化钠溶液，常温振荡30 min后，移取1.0 mL样液，加入5.0 mL考马斯亮蓝染色溶液，静置5 min，在595 nm处测定吸光度，重复测试7次，结果见表7。由表7可知，该测试方法精密度较高，标准偏差为 0.006 962，变异系数为 1.4%，符合 GB/T 274172017 合格评定化学分析方法确认和验证指南 要求；目标分析物蛋白含量远大于定量限，根据 GB/T274172017未进行方法检出限的评估。3结论在分析现有检测方法的基础上，借鉴其他行业蛋白含量测定方法来检测含蛋白改性纤维产品中的蛋白含量。使用蛋白染色方法来进行含蛋白改性纤维产品中蛋白含量的测试是可行的，但需要注意不可变更考马斯亮蓝染色溶液的配制方法，且使用酸、碱、有机溶剂萃取纺织品中的蛋白均无法测试出结果，可以使用低溶度盐溶液，利用其盐溶作用来进行测试。该测试方法精密度高，且不受纤维成分及化学性能等因素的影响，具有一定的应用价值。参考文献：1蒋大程,高珊,高海伦,等.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题J.实验科学与技术,2018,16(4):143-147.振荡时间/min1020吸光度0.3290.370振荡时间/min3060吸光度0.4990.377表6振荡不同时间测试结果重复测试次数1234吸光度0.4990.4910.4820.494重复测试次数567吸光度0.5010.4970.486表7重复性测试结果广告52