胆固醇7α-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):304-310收稿日期：20230422基金项目：国家重点研发计划（2019YFA0905300），天津市合成生物技术创新能力提升项目（TSBICIPKJGG00904）作者简介：赵昕，女，硕士，研究方向：生物催化与生物转化；Email:通讯作者：毛淑红，女，博士，教授，研究方向：甾体药物微生物转化；Email:胆固醇 7-羟化酶（CYP7A1）又称细胞色素P450 7A1 酶，是肝脏特异性微粒体细胞色素 P450家族 7 亚家族 A 成员1。在肝脏中，CYP7A1 催化胆固醇转化为 7-羟基胆固醇，从而促进胆汁酸的分解，CYP7A1 为该反应的限速酶2，对维持体内胆固醇代谢平衡起到关键的作用，其在保障胆固醇胆固醇 7-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达赵昕 杜玉瑶 殷子扬 毛淑红（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）摘 要：胆固醇 7-羟化酶（CYP7A1）是胆固醇分解为胆汁酸的限速酶，其催化胆固醇为 7-羟基胆固醇，7-羟基胆固醇是重要的甾体药物及中间体。以人源 CYP7A1 作为研究对象，首先构建了重组毕赤酵母/pPIC3.5KCYP7A1；然后对 7-羟化酶进行分子改造，之后将酶与不同来源 NADPH 细胞色素氧化还原酶（CPR）适配，以提高目的产物 7-羟基胆固醇的产量。其中突变体 G485A 将 7-羟基胆固醇的产量提高了 8.70%；5 种不同来源的 CPR 与 CYP7A1 共表达毕赤酵母菌株均可提高 7-羟基胆固醇的产量，并且罗汉果（Siraitia grosvenorii）来源的 CPR（SgCPR）与 CYP7A1 适配性最好，使 7-羟基胆固醇的产率提高了82.26%；在以上研究的基础上，构建突变体 G485A 与 SgCPR 共表达毕赤酵母菌株，最终 7-羟基胆固醇的产量提高了 133.79%，其产量为 0.25 mg/L。实验在毕赤酵母中成功异源表达人源胆固醇 7-羟化酶，并通过分子改造及与不同来源 CPR 适配的方法提高了 7-羟基胆固醇的产量。关键词：甾体药物；胆固醇；胆固醇 7-羟化酶；7-羟基胆固醇；毕赤酵母；细胞色素氧化还原酶DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230387Allogeneic Expression of Cholesterol 7-hydroxylase in Pichia pastorisZHAO Xin DU Yuyao YIN Ziyang MAO Shuhong（1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457;2.Key Laboratory of Industrial Fementation Microbiology,Tianjin 300457）Abstract:Cholesterol 7-hydroxylase（CYP7A1）is a ratelimiting enzyme that breaks down cholesterol into bile acids,which catalyzes cholesterol to produce 7-hydroxycholesterol,it is an important steroidal drug and intermediate.Taking human CYP7A1 as the research object,firstly,recombinant Pichia pastoris/pPIC3.5KCYP7A1 was constructed,and then the yield of the target product 7-hydroxycholesterol increased by sitedirected mutation and adaptation to NADPH cytochrome oxidoreductase（CPR）from different sources.Among them,the mutant G485A increased the yield of 7-hydroxycholesterol by 8.70%.The coexpression of P.pastoris with five different sources of CPR and CYP7A1 increased the yield of 7-hydroxycholesterol,and the CPR（SgCPR）derived from Siraitia grosvenorii was the most compatible with CYP7A1,which increased the yield of 7-hydroxycholesterol by 82.26%.Based on the above research,the coexpression of G485A and SgCPR in P.pastoris increased the yield of 7-hydroxycholesterol by 133.79%,and the yield was 0.25 mg/L.The human cholesterol 7-hydroxylase was successfully expressed in P.pastoris,and the yield of 7-hydroxycholesterol increased based on molecular modification of CYP7A1 and adaptation of CPR from different sources.Keywords:steroidal drugs;cholesterol;cholesterol 7-hydroxylase;7-hydroxycholesterol;Pichia pastoris;cytochrome oxidoreductase2023,39(10)305赵昕等：胆固醇 7-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达正常摄取、运输和转化方面有极其重要的作用。在体内，若胆固醇代谢异常易造成血管内壁的胆固醇沉积，形成动脉粥样硬化、胆结石等疾病，还可导致胆囊癌、结直肠癌等疾病的发生3-4。CYP7A1 依赖于氧化酶和还原酶之间特定的电子传递链进行 7 位羟基化反应5。CYP7A1 电子传递机制如图 1，NADPH 提供的两个电子转移到 CPR的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）区域，FAD 接受电子会引起 CPR 的构象变化，使 FAD 接近黄素单核苷酸（FMN）区域，之后 FAD 处的电子转移到FMN；随后 CPR 分子恢复到原来的构象，允许 FMN与 CYP7A1 分子电荷结合位点相互作用6-9，然后电子流向 CYP7A1 的血红素铁区域，通过 Fe=O 机制介导胆固醇羟基化反应10，CYP7A1 催化反应可表示为：NADPH+H+O2+胆固醇 NADP+H2O+7-羟基胆固醇。图 1 胆固醇 7-羟化酶的电子传递机理Fig.1 Electron transport mechanism of cholesterol 7-hy-droxylase7-羟基胆固醇不仅是一种胆固醇代谢产物，而且对胆汁酸合成、炎症和肿瘤等方面的治疗都有重要的作用。7-羟基胆固醇在肝脏中被转化为胆汁酸，从而促进胆汁酸的合成和分泌11。此外，7-羟基胆固醇可以减少炎性细胞浸润，降低炎症水平，从而起到抗炎作用12。最后，7-羟基胆固醇可以抑制癌细胞的增殖和转移，具有一定的抗肿瘤作用13。因此构建一株利用 CYP7A1 高效生产 7-羟基胆固醇的菌株具有极大的医学价值和工业生产价值。在构建表达胆固醇 7-羟化酶的毕赤酵母基因工程菌株的基础上，对 7-羟化酶进行理性设计与分子改造，对筛选获得的高活性 7-羟化酶适配不同来源 CPR，并在毕赤酵母中共表达，从而为 7-羟基胆固醇高效生产奠定基础。1 材料与方法1.1 材料限制性核酸内切酶（BamH I、EcoR I、Sal I 和Sac I）、Goldstar best DNA 聚 合 酶、Solution I 连 接酶、DNA 提取纯化试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒均为 TaKaRa 公司产品，胆固醇为 Diamond 公司产品，7-羟基胆固醇为 Genewiz 公司产品。通过 NCBI 数据库获得全长人源 CYP7A1 基因（GenBank:NP_000771.2），由金唯智生物技术有限公司按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化合成。质粒pPIC3.5K（含有卡那霉素抗性基因）、pPICZX（含有博来霉素抗性基因）、大肠杆菌 Escherichia coli JM 109、毕赤酵母 GS115 均由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 重组质粒 pPIC3.5KCYP7A1（WT/突变型）的构建 以合成的 CYP7A1（WT）基因为模板，通过特异性引物（表 1）PCR 扩增克隆出 WT 基因及突变基因 H111A、I114A、V281A、W284A 和 G485A，用限制性核酸内切酶 BamH I 和 EcoR I 对以上片段和 pPIC3.5K 质粒进行双酶切，切胶回收产物经Solution I 连接酶过夜连接，将连接的产物化转至大肠杆菌 E.coli JM 109，以卡那霉素抗性筛选重组转化子并测序。得到 E.coli JM 109/pPIC3.5KCYP7A1（WT/突变型）。1.2.2 毕赤酵母/pPIC3.5KCYP7A1（WT/突变型）菌株的构建 将测序正确的重组质粒 pPIC3.5KCYP7A1（WT/突变型）用 Sal I 限制性核酸内切酶单酶切线性化；电转至毕赤酵母 GS115 感受态细胞中，使用含 0.5 mg/mL G418 的 YPD 和 2.0 mg/mL G418 的 YPD 培养基筛选高拷贝菌株，提取菌株基因组进行 PCR 验证，以获得重组菌株。1.2.3 不同来源 CPR 与 CYP7A1 共表达毕赤酵母菌株的构建 将实验室保存的 5 种含不同来源 CPR 的质粒 pPICZXCPR 用 Sac I 限制性核酸内切酶单酶切线性化后电转至含 CYP7A1（WT）基因的毕赤酵母感受态细胞中；5 种 CPR 分别为人源氧化还原蛋白生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10306（hCPR）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来源氧化还原蛋白（ScCPR）、黑曲霉（Aspergillus nige）来源氧化还原蛋白（AnCPR）、大鼠来源氧化还原蛋白（RatCPR）及罗汉果来源氧化还原蛋白（SgCPR）；使用含 300 g/mL 博来霉素的 YPDS 和 2.0 mg/mL G418 的 YPD 培养基筛选高拷贝菌株，提取菌株基因组进行 PCR 验证，以获得重组菌株。1.2.4 G485A 与 SgCPR 共 表 达 毕 赤 酵 菌 株 的 构建 将重组质粒 pPICZXSgCPR 用 Sac I 限制性核酸内切酶单酶切线性化，将线性化的质粒加入含CYP7A1（G485A）基因的毕赤酵母感受态细胞中，使用含 300 g/mL 博来霉素 YPDS 和 2.0 mg/mL G418的 YPD 培养基筛选高拷贝菌株，提取菌株基因组进行 PCR 验证，以获得重组菌株。1.2.5 胆固醇的转化 在 YPD 培养基上选取构建成功的重组菌株的单菌落，接种到 30 mL YPG 培养基中，30、220 r/min 的摇床培养 24 h；按培养基 2%接种量接种到 50 mL BMGY 培养基中进行富集培养，30、220 r/min 的摇床培养 18 h，转接到 BMMY 培养基，于 30、220 r/min 的摇床继续培养 24 h；加入 0.01%底物胆固醇及 1%诱导剂甲醇，继续培养4 d，期间每 24 h 添加甲醇至 1%的浓度。取发酵液10 mL，并加入等体积乙酸乙酯轻微振荡萃取，离心后取上层有机相，浓缩至 500 L，使用薄层色谱（TLC）、气相色谱-质谱法（GCMS）及蒸发光分析产物的生成情况。薄层色谱分析条件：展开剂为石油醚乙酸乙酯=21，用含 10%浓硫酸的无水乙醇喷洒 TLC 板，高温加热显色后，可清晰分辨胆固醇及产物 7-羟基胆固醇所在的位置。气相色谱-质谱法（GCMS）分析条件：升温程序：初始温度 50，保持 2 min，以 5/min 升到270，保持 0 min，再以 2.5/min 升到 290，保持 0 min；再以 10/min 升到 310，保持 4 min，不分流进样，流速 1 mL/min。蒸发光检测分析条件：流动相为纯甲醇，进样量 10 L，载气流速 2.2 mL/min，载气温度 90。2 结果2.1 重组毕赤酵母/pPIC3.5KCYP7A1对7-羟基胆固醇产率的影响将全长的人源 CYP7A1 基因在毕赤酵母中进行表达，将毕赤酵母全细胞催化的发酵液进行萃取浓缩，用于薄层色谱（TLC）和气相色谱-质谱法（GCMS）分析，检测后确定发酵液中含有的产物为7-羟基胆固醇。薄层色谱定性分析结果（图 2）显示，图中蓝色的样品点为 7-羟基胆固醇，粉色的样品点为胆固醇。毕赤酵母 GS115 即使在投底物胆固醇的情况下，也不会将胆固醇转化为 7-羟基胆固醇，而重组菌株具有催化胆固醇生成目的产物 7-羟基胆固醇的能力。气相色谱-质谱法（GCMS）定性分析结果显示，图 3A 为 7-羟基胆固醇标品的质谱图，特征峰出现在 m/z 456（分子离子峰）、129、95、73 和 57 的位置。图 3B 为重组菌株转化产物的质谱图，特征峰与 7-羟基胆固醇标品的质谱图的特征峰相同，证明重组菌株生成的产物为 7-羟基胆固醇。2.2 CYP7A1的分子改造对7-羟基胆固醇产率的影响将利用分子生物学改造获得的 5 株突变株，进行催化胆固醇能力分析，转化产物经 TLC 分析 表 1 CYP7A1 基因野生型及突变型引物Table 1 Wild-type and mutant primers of CYP7A1 gene引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence（5-3）CYP7A1FCGCGGATCCATGATGACCACCTCTCTGATTCYP7A1RCCGGAATTCTTACAGATGTTTAAATTTATATTTAAATTCAATH111AFAAAGCCTTTGGTGCTAGGTCTATTGATCCAATGGATGGTAATACH111ARACCAAAGGCTTTGGCAGAGGTI114AFGGTCATAGGTCTGCTGATCCAATGGATGGTAATACCACTGAI114ARAGACCTATGACCAAAGGCTTTGGCV281AFAAAACCCATCTGGCTGTTCTGTGGGCCTCTCAAGCCV281ARCAGATGGGTTTTGGCTTTTTCCW284AFCTGGTTGTTCTGGCYGCCTCTCAAGCCAATACCATTCCW284ARCAGAACAACCAGATGGGTTTTGGG485AFCAGTCTAGAGCTGCTCTGGGTATTCTGCCACCACTGAG485ARAGCTCTAGACTGATCCAGTGGTGGAC2023,39(10)307赵昕等：胆固醇 7-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达（图 2）、蒸发光检测（图 4），与野生型相比发现，对 111、114 和 284 位点突变后酶的活性消失，说明这些位点对 CYP7A1 的活性有关键作用。对 281 和485 的位点突变后，CYP7A1 仍然具有活性，其中281 位点的缬氨酸突变为丙氨酸后，活性稍有降低，为突变前的 67.86%，而 485 位点的甘氨酸突变为丙氨酸后，活性提高，是野生型的 108.71%，之后选取突变体 G485A 进行后续研究。2.3 不同来源CPR对重组毕赤酵母7-羟基胆固醇产率的影响将不同来源 CPR 与 CYP7A1 共表达，转化结果如 图 5 所 示，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR 和SgCPR 都能与 CYP7A1 适配，所获得的重组菌株催化胆固醇的能力均有提高，其中 CYP7A1 与 SgCPR共表达使 7-羟基胆固醇的产率与 CYP7A1 野生型菌株相比提高了 82.26%，但与人源 CYP7A1 同源的hCPR 在共表达过程中适配性没有 SgCPR 显著。突变体 G485A 与 SgCPR 共表达毕赤酵母催化胆固醇的能力显著提高，与 CYP7A1 野生型菌株相比，产物混 标：胆 固 醇 和 7-羟 基 胆 固 醇 的 混 合 标 品；CYP：CYP7A1（WT）；GS115：毕赤酵母 GS115；111：突变体 H111A；114：突变体 I114A；281：突变体 V281A；284：突变体 W284A；485：突变体 G485AMixed labels:Mixed standards of cholesterol and 7-hydroxycholesterol;CYP:CYP7A1（WT）;GS115:P.pastoris GS115;111:mutant H111A;114:mutant I114A;281:mutant V281A;284:mutant W284A;485:mutant G485A图 2 重组毕赤酵母催化胆固醇 TLC 结果图Fig.2 TLC analysis of biotransformation result of choles-terol catalyzed by recombinant P.pastorisA：7-羟基胆固醇质谱图；B：重组毕赤酵母转化产物质谱图A:Mass spectra of 7-hydroxycholesterol.B:Mass spectra of recombinant P.pastoris products图 3 重组毕赤酵母催化生成 7-羟基胆固醇的 GC-MS 分析图Fig.3 GC-MS analysis of the 7-hydroxycholesterol catalyzed by recombinant P.pastoris生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10308产率提高了 133.79%，产量为 0.25 mg/L。3 讨论目前报道的胆固醇 7-羟化酶主要是在大肠杆菌中异源表达，但 CYP7A1 为膜蛋白，存在纯化步骤复杂、纯化蛋白浓度低、不能翻译修饰蛋白等问题。而且为了实现羟化酶在大肠杆菌中的高效表达，需要将 N 末端跨膜锚定结构域（氨基酸 2-24）的氨基酸序列优化为 MAKKT14，并且为了在层析过程中溶解膜并保持蛋白质解聚，需要在纯化过程中添加表面活性剂，如 Triton X100、Emulgen 913 等15。不仅如此，还需要使用辛基氨基琼脂糖 4B 柱和阳离子交换层析等对蛋白进行进一步纯化16。为避免复杂的蛋白纯化步骤，实验选取毕赤酵母为表达宿主，它能识别真核基因，帮助其进行转录翻译后修饰，并且可以通过高密度发酵提高 CYP7A1 表达量和催化效率17。3.1 突变体提高7-羟基胆固醇产量的分析目前对 CYP7A1 分子对接的研究主要集中在酶活性位点18，而实验是通过 Discovery studio 软件的半柔性分子对接抓取与胆固醇小分子作用关键蛋白质位点，定点突变为丙氨酸。根据对接结果（图 6），选取 5 个位点定点突变为丙氨酸，分别得到 H111A、I114A、V281A、W284A 和 G485A 突变体，这些位点存在于 CYP7A1 活性口袋附近，主要作用力为疏水作用力以及氢键相互作用，疏水作用可以维持活性中心空间结构的稳定性。对 111、114 及 284 位点突变后酶的活性消失，说明这些位点对 CYP7A1的活性有关键作用，这些位点突变后可能改变了传递电子的能力或改变结合口袋的结构等。对 281 及485 突变后催化活性变低或变高，可能是由于氨基酸极性不同导致的活性不同，氨基酸可分为亲水氨基酸和疏水氨基酸，亲水氨基酸对水分子具有一定的亲和性，疏水氨基酸对脂溶性物质的亲和性更高。由于胆固醇为非极性分子，根据“相似相溶”的性质，较容易与疏水氨基酸相互作用。实验中涉及的氨基酸极性从大到小的顺序为：His Trp Gly Ala Val Ile，突变体 485 位点甘氨酸突变为极性更小的丙氨酸后，与胆固醇形成的疏水键的作用力更强，催化活性提高；突变体 281 位点缬氨酸突变为极性更大丙氨酸后，与胆固醇形成的疏水键的作用力减弱，催化活性降低；其次也可能是由于突变位点距离胆固醇 C7 位距离的不同导致活性不同，突变位点与胆固醇分子对接位置如图 7 所示。281R突变体 H111A、I114A、V281A、W284A 和 G485A 与 CYP7A1（WT）重组毕赤酵母的产物比率Product ratio of mutant H111A,I114A,V281A,W284A and G485A to CYP7A1（WT）recombinant P.pastoris图 4 突变毕赤酵母产率比较图Fig.4 Production abilities of the mutants when compared with the wild typeGCYP7A1（WT）与 ScCPR、hCPR、AnCPR、RatCPR 和 SgCPR 共表达毕赤酵母，及 G485A 与 SgCPR 共表达毕赤酵母产物增长率（与 CYP7A1（WT）重组毕赤酵母相比）The growth rate of products of P.pastoris coexpressed with CYP7A1（WT）and CPR（ScCPR,hCPR,AnCPR,RatCPR and SgCPR）and P.pastoris coexpressed with G485A and SgCPR when compared with that of recombinant P.pastoris containing only CYP7A1（WT）图 5 CYP7A1 与不同来源 CPR 共表达毕赤酵母对胆固醇转化能力的影响Fig.5 Effects of P.pastoris co-expressed with CYP7A1 and CPR from different sources on cholesterol conversion2023,39(10)309赵昕等：胆固醇 7-羟化酶在毕赤酵母中的异源表达位点与胆固醇 C17 位上的侧链相连，与 C7 位距离较远，而 485 位点与 A 环相连，与 C7 位距离较近，改变 485 位点氨基酸的大小对催化 C7 羟基化有较大的影响。综上所述 281 和 485 位点可以作为改造位点，将其突变为更加疏水的氨基酸或改变 485 位点氨基酸的大小会对酶与底物结合有进一步影响。黄色部分分子为胆固醇，其他部分为 CYP7A1，蓝色标注位点为突变位点The yellow molecule is cholesterol,the others are CYP7A1,and the bluelabeled sites are mutation sites图 6 CYP7A1 与胆固醇分子对接结果图Fig.6 Docking results of CYP7A1 and cholesterol mole-cules图 7 CYP7A1 与胆固醇分子对接结果的二维平面图Fig.7 2D floor plan of docking results of CYP7A1 and cholesterol molecules3.2 CYP7A1（WT/突变型）与CPR适配提高7-羟基胆固醇产量的分析毕赤酵母为真核表达系统，自身含有 CPR 可帮助 CYP7A1 转移电子，但通过异源表达不同来源的 CPR 可增加产物 7-羟基胆固醇的产量。实验表明，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR 和 SgCPR 与CYP7A1 共表达菌株催化胆固醇的能力均有提高，并且 SgCPR 与 G485A 适配后催化能力更加显著。虽然 CPR 的过表达能够增强 CYP7A1 在毕赤酵母的羟基化水平，但并不是与 CYP7A1 基因同源的人源CPR 与其适配性最好，可能是由于 CYPCPR 相互作用时，不同 CPR 中的 FMN 结构域附近特定残基组成不同导致的，FMN 区域正电荷氨基酸数量显著影响其相互作用19。因此在毕赤酵母中异源表达其他 CYP450 时，可添加外源 CPR 提高转化率。根据相关文献报道，CYP450 与 CPR 相互作用中存在着一定的比例，选取合适的比例可以大大提高酶的催化活性20，因此进一步实验可以通过 CYP7A1 适配不同浓度 SgCPR，提高 CYP7A1 的转化能力。3.3 重组毕赤酵母中生产7-羟基胆固醇的分析重组毕赤酵母生产 7-羟基胆固醇，是通过胆固醇 7-羟化酶在毕赤酵母异源表达的催化胆固醇实现的，其难点在于 7-羟基胆固醇的产量很低，只有产物浓度浓缩 10-20 倍才可用仪器检测到，因此并不是酶没有表达，而是产物浓度低到难以用蒸发光等仪器发现。并且胆固醇为脂溶性物质，难于进入细胞进行催化反应，即使在助溶剂的帮助下其溶解度也很低，因此找到胆固醇进入细胞的更有效办法，可显著提高 7-羟基胆固醇产量。4 结论构建 CYP7A1 异源表达平台并对其转化胆固醇能力进行研究，获得全细胞催化胆固醇生产 7-羟基胆固醇的重组毕赤酵母菌株，通过定点突变及适配不同来源 CPR 进一步提高了 7-羟基胆固醇产量。实验为 7-羟基胆固醇的高效生产奠定了良好的基础，也为 CYP450 的高效表达提供了有效方法。参 考 文 献1Qayyum F,Lauridsen BK,FrikkeSchmidt R,et al.Genetic variants in CYP7A1 and risk of myocardial infarction and symptomatic gallstone diseaseJ.Eur Heart J,2018,39（22）:21062116.2Rizzolo D,Kong B,Taylor RE,et al.Bile acid homeostasis in female mice deficient in Cyp7a1 and Cyp27a1J.Acta Pharm Sin B,2021,11（12）:38473856.3Jiao JY,Zhu XJ,Zhou C,et al.Research progress on the immune microenvironment of the gallbladder in patients with cholesterol 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10310gallstonesJ.World J Gastrointest Surg,2022,14（9）:887895.4Srivastava A,Choudhuri G,Mittal B.CYP7A1（204 AC;rs3808607 and469 TC;rs3824260）promoter polymorphisms and risk of gallbladder cancer in North Indian populationJ.Metabolism,2010,59（6）:767773.5Omura T,Gotoh O.Evolutionary origin of mitochondrial cytochrome P450J.J Biochem,2017,161（5）:399407.6Nowrouzi B,RiosSolis L.Redox metabolism for improving wholecell P450catalysed terpenoid 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