大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析.pdf

姚文浩，吴兴隆，秦志博，等 大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析 畜牧与兽医，（）：，（），（）：大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析姚文浩，吴兴隆，秦志博，李文豪，朱惠丽，王磊，胡建和，韩艳辉（河南科技学院，河南 新乡）摘要：磷酸丙糖异构酶（）是生物体糖酵解的一种关键酶，对大片吸虫获取能量而赖以生存有着十分重要的作用。本试验根据肝片吸虫（：）的基因序列，设计带有 和 作为酶切位点的引物，以大片吸虫的 为模板，扩增大片吸虫磷酸丙糖异构酶（）基因。结果：基因开放阅读框为 ，编码 个氨基酸，理论等电点 为 ；构建的重组表达质粒 （）成功在大肠杆菌中表达，重组蛋白的分子量约为 ；重组蛋白免疫 小鼠，收取多克隆抗体，检测结果显示，能诱导较高的 抗体水平；用感染大片吸虫动物的血清检测重组蛋白的免疫原性，分析表明，重组蛋白 具有良好的免疫原性；生物信息学预测显示，主要以 螺旋和 折叠为主，转角较少，有 个较长的无规则卷曲；通过 磷酸甘油脱氢酶偶联法测定其活性，发现 酶促反应最佳 值为 ，最适温度为 。本试验结果为深入研究 的生物学功能、评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子奠定了基础。关键词：大片吸虫；磷酸丙糖异构酶；克隆；表达；酶活性分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（），：（），（），：；片形吸虫病是大片吸虫（）和肝片吸虫（）寄生于反刍动物和人的收稿日期：；修回日期：基金项目：国家重点研发计划项目（）；中原科技创新领军人才项目（）第一作者：姚文浩，男，学士通信作者：韩艳辉，博士，讲师，主要研究方向为人兽共患寄生虫病学，：。肝脏、胆管中引起的一种人兽共患寄生虫病。片形吸虫病是一种食源性寄生虫病，人类是偶感宿主，通过饮用受污染的水或水生植物而感染。该病影响全球超过 个国家的 万人，感染了全球数百万反刍动物，每年造成超过 亿美元的经济损失。近年来，农田灌溉面积扩大、湿地改造等人为活动使片形吸虫病的感染率呈上升趋势，世界卫生组织将其归类为一种被忽视的热带疾病。目前，三氯苯畜牧与兽医 年 第 卷 第 期达唑（）是治疗片形吸虫病的首选药物，然而过度使用会导致耐药性的产生，荷兰、智利、土耳其和秘鲁等地均出现了抗 虫株，这对该病的预防和控制产生了巨大影响，开发新的抗片形吸虫病疫苗候选分子迫在眉睫。大片吸虫主要依赖糖酵解获取能源赖以生存，而磷酸丙糖异构酶（）是糖酵解过程中必不可少的酶，它可以将磷酸二羟丙酮转化为 磷酸甘油醛。作为糖酵解的关键酶，广泛存在于各类生物中，科学家已从多种生物体中克隆并成功表达出该基因。有研究显示，可用于开发药物或疫苗，不仅用于克服华支睾吸虫病，还包括其他人畜共患的蠕虫病。目前，对大片吸虫 （）的研究微乎其微。本试验以大片吸虫的 为研究对象，对该基因的生物学特性进行了初步分析，为评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子的潜在能力，以及深入研究 的生物学功能奠定基础。材料与方法 菌种、质粒、实验动物大肠杆菌、（）、表达质粒 （）和大片吸虫 模板均由河南科技学院动物科技学院实验室保存；周龄 级 雄性小鼠购自河南斯克贝斯生物有限公司。主要试剂和酶 凝胶回收试剂盒（离心柱型）、高纯度质粒 小提试剂盒（离心柱型）、限制性核酸内切酶、载体、连接酶、标志物均购自 生物工程（大连）有限公司；异丙基硫代半乳糖苷（）购自北京全式金生物技术有限公司；购自美国 公司。酶活性测定试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。引物的设计与合成参照 收录的肝片吸虫基因（）核苷酸序列，通过软件设计含有限制性酶切位点和 的引物，引物由 生物工程（大连）有限公司合成。目的基因的克隆以大片吸虫的 为模板，进行 扩增。预变性 ；，个循环；延伸 ，保存。凝胶电泳鉴定并回收目的片段。目的片段与 连接过夜，按照转化说明书将连接产物转化入 感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，鉴定并测序。基因的序列测定及生物信息学分析对鉴定正确的质粒进行生物信息学分析。用 软件进行基因序列分析，并进行序列相似性比较。运 用 在 线 网 站（：）对 蛋白序列进行亲疏水性分析，并在网站（：）上进行参数分析，最后利用在线网站（：）预测其三级结构。运用 软件分析 的蛋白分子量和理论等电点（）。重组质粒 （）的构建对 中的测序正确样品提取质粒，并进行双酶切，并与双酶切的 （）质粒 连接过夜，构建重组表达质粒 （）。重组质粒在大肠杆菌中的表达与表达产物的纯化 按照转化说明书将 中的连接产物转化入大肠杆菌 （）感受态细胞中，经 扩增、酶切及测序鉴定正确后，大量扩增，并进行诱导表达。获得可溶性重组蛋白，用 进行蛋白的纯化，验证纯化效果。动物免疫与免疫血清制备选择 周龄 级 小鼠 只，随机分成 组，分别为免疫组（）、佐剂对照组（）和空白对照组（）。免疫组每次每只注射 含 佐剂和 纯化的重组蛋白 的乳化剂；佐剂对照组每次每只注射 含 佐剂和 的乳化剂；空白对照组每次每只注射 的。组均腹腔注射，每隔 周免疫 次，共免疫 次。小鼠免疫之前（阴性血清）以及每次免疫之后 周采血，分离并收集血清，备用。重组蛋白的 分析将 重组蛋白 进行，后转移至硝酸纤维素膜上，加入 的 脱脂奶粉，封闭过夜。随后分别与感染大片吸虫羊的血清（）、未感染的阴性血清（）共孵育，室温静置 ，洗涤 次，与兔抗羊 （）室温孵育 ，洗涤 次，用自动化学发光图像分析系统进行成像分析。检测特异性 抗体水平以纯化的重组蛋白 为抗原包被 板，以 中制备的免疫血清为一抗，检测 组小鼠免疫前后血清中抗 特异性抗体 的效价变化。以包被缓冲液稀释抗原浓度至 ，每孔，过夜。用 洗涤 次后，每孔加入 牛血清白蛋白进行封闭，孵 育 。洗涤 次，每孔加入 被检血清（），孵育 。洗涤 次，加入羊抗小鼠 （）孵育 。洗涤 次，然后加入可溶性 底物 ，避光显色，加入 （孔）终止反应，用 公司的酶标仪测定 处的吸光值。重组蛋白的酶活性分析采用 磷酸甘油脱氢酶偶联法对该重组蛋白进行酶活性研究，偶联反应式如下：型甘油醛磷酸二羟丙酮磷酸；二羟丙酮磷酸 磷酸甘油。反应的溶液为 缓冲液（三乙醇胺，）添加 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（），个单位的 磷酸甘油脱氢酶（）和 型甘油醛磷酸（）。加入 的 开始反应。以质粒（）作为阴性对照。值对酶活性的影响调节反应体系 值依次为 、。分别测定上述反应体系在各个 条件下 内 处吸光度的变化情况。温度对酶活性的影响选用、和 共 个温度点，分别测定上述反应体系在各温度条件下 内 处吸光度的变化情况。动力学参数测定反应混合物的最终体积为 的 缓冲液，含有 （）、（）、单位的 和 的。通过在最佳温度和最佳 值下改变 浓度（），测量初始速度，然后采用双倒数法作图，确定 的米氏常数和最大反应速度。结果 基因扩增 克隆基因，凝胶电泳显示，在 处可见明显片段（图）。分子质量标准；产物。图 基因的 扩增 相似物种 的 分析选择分别来自肝片吸虫（，简称）（：），捻转血矛线虫（，简 称）（：），日本血吸虫（，简称）（：），曼氏血吸虫（，简称）（：），马来丝虫（，简称）（：），秀丽线虫（，简称）（：）和 人（，简称）（：）个物种的 与所得大片吸虫的 序列进行比对，结果显示 编码的氨基酸序列与其他物种 基因相似性分别为 （肝片吸虫）、（人）、（血吸虫）。用 软件将该 所编码的氨基酸序列与上述 中已经公布的其他物种的 氨基酸序列进行分析，发现该序列含有 活性功能位点序列 （图）。图 大片吸虫 基因编码的氮基酸序列与其他物种 序列比对分析畜牧与兽医 年 第 卷 第 期 基因编码蛋白的分析 基因开放阅读框为 ，编码 个氨基酸，如图 所示。分析 的二级结构，发现该蛋白以 螺旋为主，分别位于 、；折叠相对 螺旋较少，主要位于 、；转角区较少；较长的无规则卷曲分别位于、。结合柔性区域和表面可及性的预测结果表明，蛋白主要含有 个线性 细胞抗原表位，分别位于氨基酸序列的第 、位。此外，对目的蛋白亲疏水性（图）以及三级结构预测（图）均进行了分析。分析显示，该蛋白分子量为 ，理论等电点 为 。二级结构与 细胞抗原表位分析；疏水性分析；三级结构预测。图 蛋白的生物信息学分析 重组质粒 （）的鉴定重组质粒 （）酶切鉴定分别能得到 的目的基因和相应大小的重组质粒片段，说明该重组质粒构建成功（图）。纯化大量扩增的重组菌菌液 值为 时，加入终浓度为 的，诱导 ，此时上清液表达量最高。菌液 离心，收取上清液，用 纯化柱进行蛋白纯化。分析表明，在上清液中收集到了重组蛋白 （图）。标准分子量；和 双酶切 （）质粒；未酶切的 （）质粒。图 重组质粒 酶切鉴定 蛋白分子量标准；未纯化的；纯化后的。图 重组蛋白 的纯化 重组蛋白的 分析将重组蛋白进行 之后进行 分析，结果显示，用感染大片吸虫的羊血清作为一抗时，处有一明显的识别条带，而阴性对照组在 处未有条带出现，表明重组蛋白具有良好的免疫反应性（图）。蛋白分子量标准；一抗为大片吸虫感染羊的血清；一抗为阴性血清。图 重组蛋白 的 分析 小鼠血清抗 蛋白特异性抗体的检测 检测 组小鼠免疫前后血清中抗体 的效价变化。结果显示，重组蛋白一免、二免、三免后特异性抗体水平较 佐剂组和空白对照组显著升高（），在三免后其抗体水平达到最大值；而佐剂对照组和空白对照组血清中抗 的特异性 抗体水平均未出现明显变化（图）。图 检测小鼠抗 特异性 抗体水平 酶活性的测定采用 磷酸甘油脱氢酶偶联法对 进行酶活性的测定，并进一步研究了 值和温度对其活性的影响。结果显示（图），重组蛋白 具有一定的 活性，其酶促反应最佳 值为 ，最佳温度为 ；（）空载体蛋白不具有 活性。酶促反应动力学结果显示，米氏常数和最大反应速 度 分 别 为（）和 （）。图 值（）和温度（）对 酶活性的影响 讨论随着现代社会的进步，人们对粮食的需求不断提高，绿色食品、人与自然和谐共存的概念已成为当今时代的主流，因此，大片吸虫病作为一种重要的食源性疾病引起了人们的广泛关注。吸虫感染是许多发展中国家人类残疾和死亡的主要原因，并且仍然是 世纪医学面临的最重要挑战之一。诊断片形吸虫病有 种常见的方法：一种是依赖于被屠宰动物肝组织中成虫的宏观鉴定，另一种是基于粪便样本中寄畜牧与兽医 年 第 卷 第 期生虫虫卵的显微镜检测。然而，这 种方法准确性较低且具有一定的缺点：第 种方法局限性在于不能应用于人类疾病的检测；第 种方法的缺点在于直到感染晚期才能检测到虫卵，而且虫卵会间歇性地从胆管中分泌出来。近年来，与粪便标本的常规显微镜检查相比，免疫学技术变得更加敏感和特异，并且更受青睐。为苯并咪唑类中专用于治疗片形吸虫病的药物，对片形吸虫有明显驱杀效果，对牛和鹿大片吸虫病等均有效。然而，耐药性虫株的出现给本病的防治带来了极大困难，因此，对单一药物治疗大片吸虫病的依赖性是该病未来面临的严峻挑战。寻求抗大片吸虫病候选疫苗成为一种新的治疗方法。是糖酵解途径中的一种关键酶，几乎存在于所有类型的细胞中。在高等动物中缺乏 酶可能会引起溶血性贫血，严重的甚至会导致生物个体死亡。目前，在生物体内，的酶学活性没有其他酶类可以替代。属于较古老的一类酶家族，其在真核原核分化之前就已经形成。本文成功地克隆了 基因，并且重组质粒 （）在大肠杆菌中呈现可溶性表达。运用 对比，与肝片吸虫 的基因相似度高达 。生物信息学分析显示，该重组蛋白 细胞抗原表位较多，表达的分子量为 ，理论等电点 为 。的酶活性位点附近的残基序列具有很高的保守性，目前已知的 都具有高度保守的序列特征。生物信息学分析发现，活性功能位点序列为。目前，在血吸虫的研究中较为深入，被 推荐为曼氏血吸虫病的 种候选抗原基因之一。等从曼氏血吸虫中分离出一段与 序列同源的全长，并在大肠杆菌中表达了，通过免疫亲和纯化可溶性表达产物，又进一步证明该表达产物具有 活性，且能被具有免疫保护作用的单克隆抗体（）所识别，说明 是非常有前景的血吸虫候选疫苗。此外，日本血吸虫 已经被成功地克隆并表达。等和 等克隆并优化了日本血吸虫磷酸丙糖异构酶（）的密码子，同时构建了不同类型的疫苗，包括 疫 苗（、）、重组蛋白疫苗（）和重组腺病毒疫苗（），均诱导了很好的减虫率和减卵率。本试验 结果显示，重组抗原 具有较好的抗原性；结果指出，与佐剂对照组和空白对照组相比，诱导小鼠产生了较高水平的特异性 抗体，推测重组蛋白在宿主体内可以诱导一定的免疫保护效果，为以后的动物免疫保护试验及 疫苗的制备提供依据。可以催化 磷酸甘油醛与二羟丙酮磷酸之间的可逆反应，这一转换过程存在于几乎所有包括三糖磷酸脂代谢途径中，如糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及脂肪酸的生物合成等。关于 的酶活性分析，磷酸甘油脱氢酶偶联法是常用的一种研究该酶活性的方法，本试验运用此方法对 进行了酶活性测定，结果显示，酶活性测定的最佳反应条件为 、温度 ，而阴性对照 （）并未显示有 的活性；酶促反应动力学分析显示，米氏常数和最大反应速度分别为（）和 （）。本试验结果与之前报道的其他物种 的酶活性分析有一定的 相 似 性，例 如，肝 片 吸 虫 （，），日本血吸虫 （，），贾第虫 （，），猪带绦虫（，）和尖孢镰刀菌 （，）。综上所述，本文成功克隆表达了，并对其抗原性进行了初步分析，为深入研究 的生物学功能及评价其作为大片吸虫病疫苗候选的潜力奠定基础。参考文献：，（），（）：，（）：，（）：吕庆博，李娟，常巧呈，等 片形吸虫病免疫学诊断技术研究进展 黑龙江畜牧兽医，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：徐剑，周君，刘晓红，等 蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因及其编码蛋白的生物信息学分析及分子进化研究 江苏农业学报，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：要瑞丽 牛羊用抗肝片形吸虫复方三氯苯达唑颗粒的研究与应用 兽药市场指南，（）：，（）：吴华俊 松墨天牛磷酸丙糖异构酶基因的克隆及表达分析 广州：华南农业大学，汪世平，陈秀春，高冬梅 我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，（）：，（）：，（）：，：苏会敏 捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因克隆、表达、酶活性分析及重组谷氨酸脱氢酶活性测定 南京：南京农业大学，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：畜牧与兽医 年 第 卷 第 期