gfp基因的克隆与表达.doc

基因工程实验设计

题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达
专业：生工1001 姓名：刘会淼
2013年3月13
实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。

实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。

1. 材料与方法：
1.1.1 实验材料
克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ
1.1.2 仪器设备
Eppendof离心机、电泳仪 、电子天平 、台式离心机 、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器 、紫外灯、生物洁净工作台 、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、灭菌枪头 、平板封口膜、离心管
1.1.3 试剂及溶液

分装后于121 ℃ 高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；
溶液Ⅰ 50 mL

葡萄糖
50 mmol/L
Tris-Cl (pH 8.0)
25 mmol/L
EDTA (pH 8.0)
10 mmol/L
121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；
溶液Ⅱ 100 mL

NaOH
0.2 mol/L
SDS
1% (W/V)
用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；
溶液Ⅲ 100 mL

KOAc (5 mol/L)
60 mL
冰乙酸
11.5 mL
H2O
28.5 mL
121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；
氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1 mol/L CaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液 0.5 µg/mL；LB/Kan（50 µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇 ：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃；
1.2方法：
1.2.1 大肠杆菌DH-5α (pEGFP-N3)染色体DNA的提取
1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱
⑵，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
1.2.4实验原理
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
1.2.5、实验步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 
 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋 白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 
 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 
 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 
 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移 至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 
7、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及２.５ 倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。 －２０℃ 沉淀３０min。12000rpm15min，弃上清
8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。
9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。
10、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ。
11、琼脂糖凝胶电泳检测
注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。
DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。

1.3.1ＰＣＲ扩增
1.3.2实验目的
１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。
２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。
３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。
1.3.3实验原理
１、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。
２、ＰＣＲ反应体系
　　 引物、dNTP、 Mg２＋ 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。
３、ＰＣＲ循环参数
① 9５℃ 5min
② 9５℃ 30s
③ 5２℃ 30s
④ 72℃ 30s
⑤ goto② ２９times
⑥ 72℃ 10min
1.3.4器材
1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统
2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液
3，引物：

1.3.5实验步骤
１、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 　　　
　dd water 　　　　　　　　10.5ul
10×PCR buffer（不含MgCl2） 　　　　　　　3ul
25mM MgCl2 　　　　　　　2ul
10mmol/L dNTP 　　　　 　　　　　 1ul
10μmol/L 引物1 　　　　　　　　 1ul
10μmol/L 引物 2 　　　　　　　　 1ul
模板 　　　　　　　　　　　　　 1ul
　 Taq酶 　　　　　　　　　　　　　 0.5ul
总体积 　　　　　　　　　　　 20ul
２、在离心机中混匀。
３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。
４、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测

1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接
1.4.1、实验目的
1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。
2. 掌握DNA体外连接的方法。
1.4.2，实验原理
1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：
DNA分子大小
DNA分子构象
琼脂糖凝胶浓度
电泳所用电压
电泳缓冲液
2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。
3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。
1.4.3，仪器
1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65℃ 水浴锅
2，PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker
1.4.4，实验步骤
1，2%琼脂糖凝胶电泳
2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量
3，加入5个凝胶体积量的DR-Ⅰ Buffer
4，混匀 65℃加热融化凝胶块
5，加入DR-ⅠBuffer量的1/2 体积的DR-Ⅱ Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇
6，将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液
7，加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液
8，加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液
9，同8
10，将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测
11，链接反应（冰上操作）
在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：
纯化的目的DNA片段 4.5ul
Vector 0.5ul
连接液 5ul
混匀 16℃连接过夜
1.5 DH-5α 和BL-21感受态细胞的制备
1) 将0~4 ℃保存的DH-5α 和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
1.6 感受态细胞的转化
1) 取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。
1.7碱法提质粒
1) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。
2) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。
3) 向离心管中加入150 ml用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。
4) 加入200 ml新配制的溶液 Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。
5) 加入150 ml用冰预冷的溶液 Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。
6) 用微量离心机于4 ℃、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。
7) 加等体积氯仿400 ml抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。
8) 吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 ℃、11000 rpm离心5分钟，弃上清。
9) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 ℃、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 ml超纯水溶解质粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 ℃处理1小时后于-20 ℃贮存。
1.8酶切鉴定
1) 取提取的质粒8 ml于另一微量离心管中，加入2 ml Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。
2) 离心，使溶液聚集在管底部。
3) 37 ℃，酶切反应。
1.9琼脂糖凝胶电泳
1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 ℃左右。
2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。
3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。
4) 吸取10 ml的质粒与2 ml的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。
5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。
6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。
7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。
2.0 PCR-聚合酶链式反应
1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分
PCR反应体系
各成分的量
模板DNA
0.1 ml
P1(20 mM)
0.2 ml
P2(20 mM)
0.2 ml
dNTPs(10 mM)
0.4 ml
Taq酶(5 U/ml)
0.2 ml
10×PCR buffer
2 ml
ddH2O
16.9 ml
Total
20 ml
2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火60-55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10个循环，每个循环降0.5 ℃。变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 20个循环，72 ℃延伸 2 min。
3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。
4) 取8 ml扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。
2.1 pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21
1) 取100 μl感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
2) 42℃水浴热激70 s，冰上放置2 min。
3) 加入200 μl 含抗生素的LB液体培养基，37 ℃，60 r/min震荡培养30 min。四支EP管中加入0.5 μl 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。
4) 吸取200 μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培养倒置12-16 h。
2.2重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达
1) 取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃ 150-220 r/min过夜培养。
2) 将20 μl菌液按1：50—100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃ 200r/min培养2h。
3） 按IPTG: LB培养基按1:1000加入2 μl的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。
4） 用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。