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人线粒体 DNA 荧光定量 PCR 检测方法的建立

【摘要】 建立 SYBR Green I 实时荧光 PCR 定量检测人线粒体 DNA

的方法。 选取人线粒体 DNA 高度保守基因片段， 将该基因片段与 pCF-T

载体连接后，转化入 E.coli DH5a，提取重组质粒 PCR 及测序鉴定后，

作为阳性模板建立 SYBR-Green I 荧光定量 PCR 标准曲线和熔解曲线。

结果表明：构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含 101～108 拷

贝时,扩增反应 CT 值与拷贝数的对数成线性关系)， 相关系数为 0.997。

批内和批间重复性测定的变异系数分别为 1.23%～3.29%以及 3.10%～

5.21%。我们成功建立了实时荧光定量 PCR 检测人线粒体 DNA 的方法，

该方法可作为进一步研究线粒体 DNA 的方法，在相关疾病诊断和监测

中具有一定的应用前景。

【关键词】 SYBR Green I；荧光定量 PCR；线粒体 DNA；聚合酶

链反应；人

Abstract ： To estiblish a SYBR-Green I fluorescent

quantitative PCR method to detect human mitochondrial DNA.Human

mitochondrial DNA was analyzed and special primers were designed

and synthesized according to the conserved gene sequence. The

specific fragment was cloned into pCF-T vector which was

transformed into E.coli DH5a. The positive recombinant plasmid

identified by sequencing was used as quantitative template to

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generate standard curve and melt curve. Results showed that the

standard curve succesfully showed a linear relationship between

cycle threshold(Ct)and template concentration ranging from 101

to 108 copies,and the correlation coefficient was 0.997.The

coefficient of variation values for both intra-experimental and

inter-experimental reproducibility ranged from 1.23% to 3.29 %

and 3.10% to 5.21%, respectively.It means that the method for

detecting human mitochondrial DNA with fluorescence

quantitative polymerase chain reaction is developed

successfully.It shows good repeatability and sensitivity in

detection of human mitochondrial DNA. This method can facilitate

the potential applications in the fields of laboratory diagnosis

and detection.

Key words：SYBR Green I; Fluorescent qunantitative PCR;

Mitochondrial DNA；Polymerase chain reaction；Human

1引言

线粒体作为真核细胞中一种重要而独特的细胞器， 其性状和数量

的改变与人的疾病密切相关。研究线粒体与疾病的关系，既有理论意

义，在医学上也有潜在的应用前景。称为细胞动力工厂的线粒体，因

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其生命周期有限，具有高的更新率，形态、大小、数量和分布常因细

胞种类不同而异。本研究旨在建立人线粒体 DNA 荧光定量 PCR 方法，

为进一步研究线粒体 DNA 与人的疾病的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人 EDTA 抗凝血 2 ml，菌种为本室保存的大肠杆菌 E.coli DH5

a。

1.2 试剂

pCF-T 连接试剂盒、PCR 反应试剂盒、DNA 产物纯化试剂盒、琼

脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自 TIANGEN 公司；

BigDye Terminator v3.1 试剂盒、SYBR PCR Mastermix 购自 ABI 公

司；人淋巴细胞分离液购自灏洋生物公司。

1.3 仪器

BIO-RAD 公司 iCycler 荧光定量 PCR 仪，HERAEUS 公司高速离心

机 BIOFUGEPICO，ABI 公司 9700 PCR 扩增仪，大和公司恒温金属浴，

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