大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响.pdf

研究论文大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响乔君1，宫登科，刘格尔3，陈玲嫣3，伍圆明，詹依，郭勇，孟祥宇1，王小元*1,2.3（1.食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江南大学，江苏无锡2 1412 2 2.江南大学国际食品安全联合实验室，江苏无锡2 1412 2：3.江南大学生物工程学院江苏无锡2 1412 2）摘要：大肠杆菌胞外存在复杂且种类繁多的生物膜组分，这些生物膜组分不仅在合成和组装过程中耗费大量的能源和底物，且某些组分还存在巨大的致病风险。为减少这些不利影响，作者采用Crisp-Cas9基因编辑技术，从基因水平分别去除大肠杆菌MG1655中非必需生物膜组分，构建了一系列非必需生物膜组分缺失突变菌株。对突变株的细胞特性进行考察，筛选具有优异特性的突变菌株。结果显示，敲除鞭毛fliE-RfliY-TflhE-D、4型英膜、睡液酸和聚-1,6-葡萄糖胺基因簇能促进菌株在M9培养基中的生长；敲除鞭毛基因簇flgV-L和胞外多糖类组分有利于PHB合成；敲除胞外多糖类组分基因簇或鞭毛的4个基因簇，能增强菌株膜通透性；去除大肠杆菌核心多糖能重塑代谢调控，促进克拉酸的生产。关键词：大肠杆菌；生物膜；克拉酸；聚羟基丁酸酯中图分类号：Q815文章编号：16 7 3-16 8 9（2 0 2 3)11-0 0 42-13DOl:10.12441/spyswjs.20210918001Absence of Key Biofilm Components Affect CellPerformances in Escherichia coliQIAO Jun,GONG Dengke,LIU Geer,CHEN Lingyan,WU Yuanming,ZHAN Yil,GUO Yong,MENG Xiangyul,WANG Xiaoyuan2(1.State Key Laboratory of Food Science and Resources,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.InternationalJoint Laboratory on Food Safety,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.School of Biotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi 214122,China)Abstract:Escherichia coli possesses a complex and diverse array of extracellular biofilmcomponents.These biomolecules not only consume a large amount of energy and substrates duringtheir synthesis and assembly,but certain components also present huge risks for pathogenicity.Inorder to mitigate the adverse effects,Crisp-Cas9 gene-editing method was employed to removenon-essentia biofilm components from Escherichia coli MG1655 at the genetic level.A series ofmutant strains with deleted non-essential biofilm components were constructed,and the cellular收稿日期：2 0 2 1-0 9-18基金项目：国家重点研发计划项目（2 0 18 YFA0900300）；内蒙古自治区科技支撑计划项目（2 0 19 CG302）。作者简介：乔君（19 8 5），男，博士，高级工程师，主要从事微生物膜壁结构改造、优良底盘菌株构建研究。E-mail:*通信作者：王小元（19 6 5一），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事微生物细胞膜和细胞膜壁组成、结构及功能研究。E-mail:42JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 11 2023修回日期：2 0 2 1-11-0 5研究论文乔君，等：大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响characteristics of these mutant strains were investigated to identify those with superior performances.The results showed that knockout of genes encoding flagellum(fliE-R,fliY-T,and flhE-D),type 4capsule,sialic acid and poly-1,6-glucosamine could promote the growth of mutants in M9 medium.Deletion of flagellar gene clusters flgN-L and exopolysaccharide components enhanced PHBsynthesis,while knocking out four gene clusters related to extracellular polysaccharide componentsor flagella could enhance the membrane permeability.The removal of core polysaccharides fromEscherichia coli could remodel metabolic regulation and promote the production of colanic acid.Keywords:Escherichia coli,biofilm,colanic acid,polyhydroxybutyrate大肠杆菌生物膜由多糖、脂质、蛋白质、胞外DNA、蛋白质等组成-4。生物膜在维持结构完整性和刚性5-7 、保护菌株免受不利环境影响8-11以及促进细菌和宿主细胞12-13 之间的相互作用等方面至关重要。但是，一些生物生物膜组分可对工业生产造成潜在的不利影响。例如在食品工业中，生物膜会增加产品变质或被病原微生物群污染的风险14；在医疗领域，植人物或针管上的生物膜会引起患者严重感染5。此外,含有生物膜的病原菌会导致抗生素耐药,形成休眠细胞,增加治愈难度和感染风险。对于工业发酵行业而言，生物膜的形成会消耗一定的底物和能源，而这些底物和能源本可以更好地促进细胞生长。其次,生物膜会阻碍营养物质的吸收，导致菌体营养受限或生长缓慢。最后，生物膜可介导生物污垢的形成，从而减少设备传热,增加腐蚀,缩短发酵设备的使用寿命17-19 。菌毛、鞭毛和卷曲纤维是存在于细胞表面的大分子蛋白质附属物，菌毛在生物膜的形成、附着、侵袭和细胞运动等方面发挥着重要的作用2 0-2 1。卷曲纤维也介导细胞间黏附和侵袭，促使菌落在宿主体内定植,增加致病风险。卷曲纤维由csGBAgDEFG操纵子编码合成13,2-2 3。鞭毛是另外一种存在于大肠杆菌生物膜上的大分子蛋白质附属物,在生物膜的合成、运动性和趋化性中发挥作用2 4。鞭毛的合成和组装由4 个基因簇,共50 个基因的参与2 5-2 7,分别为flhEABcheZYBRtaptarcheWAmotBCflhCD、f l i YZ A CDSTfliEFGHIJKLMNOPQR.fIgNMQBCDEFGHIJKL大肠杆菌的非必需生物膜组分中，除含有上述蛋白质类附属物外，还包含大量不同种类的胞外多糖。纤维素是自然界中发现的最丰富的有机聚合物，细菌通常产生纤维素作为细胞外成分，用于机械和化学保护，细菌纤维素由9 个基因编码合成bcsGFEyhjRQbcsABZC。唾液酸是单体以独特的-(2,8)和(或)-(2,9)键连接的直链聚合物,具有促进婴幼儿神经系统发育的作用。唾液酸由6 个基因簇编码合成nanRATEKyhcH。克拉酸又称M-抗原，是由肠道细菌产生的具有高质量分数的L-岩藻糖(约30%)的胞外多糖。据报道,由肠道微生物产生的克拉酸可以延长宿主的寿命,具有延缓衰老的作用2 8-31,克拉酸在食品、化妆品和医药等领域具有广阔的应用前景。脂多糖是微生物产生的强力毒素，由类脂A、核心多糖和 O-抗原组成32-34。在大肠杆菌中,类脂A是必需组分，核心多糖和O-抗原是非必需生物膜组分，去除核心多糖和O-抗原能够起到减毒效果。核心多糖由14个基因参与合成WaaDFCQGPSBORYZUL34。O-抗原由11个基因参与合成操纵子rfbBDACXglfiwbbHIJKL35。肠杆菌共同抗原(ECA)位于许多肠致病菌外膜,是一种由3个氨基糖重复单元组成的碳水化合物抗原3。4型荚膜是大肠杆菌的表面保护组分，可偶联于膜蛋白质表面，为菌体提供物理、化学压力保护，在菌体与环境间的相互作用中发挥重要作用。4型荚膜主要由7 个基因簇合成ymcDCBAyccZetpyccC(36-37。聚-1,6-N-乙酰葡萄糖胺是一种新发现的胞外多糖，是主要的生物膜黏附素,对生物膜的产生及维持其完整性起着重要作用。聚-1,6-N-乙酰葡萄糖胺由4个基因编码合成pgaABCDI38。聚羟基丁酸酯(PHB)是微生物为储存过量碳合成的生物大分子,其在细胞内形成不溶的球形内含物或颗粒39-41。PHB具有生物降解性、生物相容性、压电性等性质，在生物降解塑料、组织工程支架等领域有广泛的应用42-4。为考察去除大肠杆菌非必需生物膜组分对菌株生长和产物合成效率造成的影响，作者首先筛选出大肠杆菌MG1655中非必需生物膜组分，再采用Crispr-Cas9基因编辑技术敲除MG1655基因组中食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期43RESEARCHARTICLEQIAo Jun,et al:Absence of Key Biofilm Components Affect CellPerformances in Escherichiacoli各生物膜组分的合成基因簇，构建了缺失不同生物膜组分的突变菌株,并考察其生长和表型变化。鉴于微生物具有储存过量碳合成PHB的特性，作者以含有PHB合成关键基因的质粒pBHR68为探针，考察去除大肠杆菌的非必需生物膜组分能否节约底物和能源。作者所在实验室经前期研究发现，通过去除大肠杆菌菌毛和ECA可以有效减少碳源消耗，提高细菌生长速度，并显著提高PHA和L-苏氨酸产量。因此，作者进一步对大肠杆菌MG1655中其他非必需生物膜组分进行研究。材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1主要试剂卡那霉素、氨芊西林、壮观霉素、异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG):西格玛-奥德里奇（上海）贸易有限公司;DNA聚合酶：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒提取试剂盒和基因组提取试剂盒：上海生工生物工程有限公司；PCR产物纯化试剂盒和凝胶纯化试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；其他均购自中国医药集团有限公司。1.1.2主要仪器设备PCR仪(ETC-811)：广州东盛生物科技有限公司；核酸蛋白质定量仪（Nanodrop2000)：赛默飞世尔科技（中国)有限公司；紫外分光光度计（UV-1800PC)：上海美谱达股份有限公司；水平核酸电泳仪(DYCP-31DN)：北京六一股份有限公司；电转仪（MicroPulser）：美国伯乐股份有限公司；酶标仪（Cytation5)：美国伯腾股份有限公司；荧光分光光度计（Hitachi）：日本日立公司。1.2菌株、质粒和引物本研究所用菌株、质粒及其遗传特性见表1。所用引物序列见表2，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。表1本实验中所用菌株、质粒及特性Table 1 Strains and plasmids used in this study and their characteristics菌株和质粒TurboMG1655WQM013WQM014WQM015WQM016WQM017WQM018WQM019WQM020WQMO22G菌株WQM023WQM024WQM025MG1655/pBHR68WQM013/pBHR68WQM014/pBHR68WQM015/pBHR68WQM016/pBHR68WQM017/pBHR68WQM018/pBHR68WQM019/pBHR68遗传特性E.coli,F proA*B+lacl AlacZMI fhuA(l a c-p r o A B)g l n V g a l R(z g b-2 10 :T n 10)野生型大肠杆菌，F-入-rph-1MG1655敲除fliEFGHIJKLMNOPQRMG1655敲除fliYZACDSTMG1655敲除flgNMABCDEFGHIJKLMC1655敲除flhEABcheZYBRtaptarcheWAmotBAflhCDMG1655敲除csgCABDEFGMG1655敲除waaQGPSBOJYZULCFDMG1655敲除rfbBDACXglfwbbHIJKLMG1655敲除wzawzbwzcwcaABCwzywcaEFgmdfelgmm wcalmanCBwca.JwxzKLMMG1655敲除ymcDCBAyccZetpyccCMG1655敲除bcsGFEyhjRQbcsABZCMG1655敲除nanRATEKyhcHMG1655敲除pgaABCDMG1655表达pBHR68质粒WQMO13表达pBHR68质粒WQM014表达pBHR68质粒WQM015表达pBHR68质粒WQM016表达pBHR68质粒WQM017表达pBHR68质粒WQM018表达pBHR68质粒WQM019表达pBHR68质粒来源NEBCGSC6300本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究44JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 2023研究论文乔君，等：大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响续表1菌株和质粒WQM020/pBHR68WQM022G/pBHR68WQM023/pBHR68WQM024/pBHR68WQM025/pBHR68pCaspTargetFpTargetF013pTargetF014pTargetF015pTargetF016pTargetF017pTargetF018质粒pTargetF019pTargetFO20pTargetF022pTargetF023pTargetF024pTargetF025pBHR68引物名称F1-013R1-013F2-013R2-013TF-013-FTF-013-RT-013-FT-RF1-014R1-014F2-014R2-014TF-014-FTF-014-RT-014-FF1-015R1-015F2-015遗传特性WQM020表达pBHR68质粒WQM022G表达pBHR68质粒WQM023表达pBHR68质粒WQM024表达pBHR68质粒WQM025表达pBHR68质粒repA 101(Ts)kan Pcas-cas9 ParaB-Red lacFPtrc-sgRNA-pMB1pMBl aadAsgRNApMB1aadA sgRNA-fliEFGHIJKLMNOPQRpMBIaadA sgRNA-fliYZACDSTpMB1 aadA sgRNA-fgNMABCDEFGHIJKLpMBI aadA sgRNA-flhEABcheZYBRtaptarcheWAmotBAflhCDpMB1 aadA sgRNA-csgCABDEFGpMBIaadAsgRNA-waaQGPSBOJYZULCFDpMB1 aadA sgRNA-rfbBDACXglfwbbHIJKLpMBl aadA sgRNA-wzawzbwzcwcaABCwzywcaEFgmdfelgmmwcalmanCBwcaJwxzKLMpMBlaadA sgRNA-ymcDCBAyccZetpyccCpMBl aadA sgRNA-bcsGFEyhjRQbcsABZCpMB1 aadA sgRNA-nanRATEK yhcHpMB1 aadA sgRNA-pgaABCDpBluescript SK-carries phaCAB from Ralstonia eutropha表2 本实验中用到的引物Table 2All primers used in this study引物序列（5 3）TGGGTGGGTTACCAGTTCAAGAGATGCCGACAGTCAGCAAAAAGCCTCAGTTTCTATGCGCATAGAAACTGAGGCTTTTTGCTGACTGTCGGCATCTCTTGCTGACTGTTAGAAGCATCGTGCCGTCGAATTCACGCACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCGTGCGTGAATTCGACGGCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGGCCGTCGAATTCACGCACGGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGGCAACTTCCTGTACGTGTTCTATATCAGAAGAAGGCAGGCACAACGAAAGCAAGGTAAAGCTTTACCTTGCTTTCGTTGTGCCTGCCTTCTTCTGATATAAAACTCACCATTCAACAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCTTGTTGAATGGTGAGTTTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGAAACTCACCATTCAACAAGGCTGATTGTAGTGAAAGTGTTGGTCGCTACCTAATGAATCCAGTCAGGAACCGACGCTATATATATAGCGTCGGTTCCTGACTGGATTCATTAGGTAGCGA来源本研究本研究本研究本研究本研究文献2 7 文献2 7 本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究本研究文献2 8 AGCCTCCGATGTGTGTTG食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期45RESEARCHARTICLEQIAO Jun,et al:Absence of Key Biofilm Components Affect CellPerformances inEscherichiacoli续表2引物名称R2-015TF-015-FTF-015-RT-015-FF1-016R1-016F2-016R2-016TF-016-FTF-016-RT-016-FF1-017R1-017F2-017R2-017TF-017-FTF-017-RT-017-FF1-018R1-018F2-018R2-018TF-018-FTF-018-RT-018-FF1-019R1-019F2-019R2-019TF-019-FTF-019-RT-019-FF1-020R1-020F2-020R2-020TF-020-FTF-020-RT-020-FF1-022GR1-022GF2-022G引物序列（5-3）TGAACCTGAAGTTGTTGCTCCCAGACACTGAATCAACAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCTGTTGATTCAGTGTCTGGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCCAGACACTGAATCAACAGGCCCACAAGCAGAAGAAGGACTTCCCAGATAAATCGCATGATAGAGTGCTCCAAGGCGCCTTGGAGCACTCTATCATGCGATTTATCTGGGAAGTGCGTAACAGCCGTCTAAAAACGCACTATGCGTCGCATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCATGCGACGCATAGTGCGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGACGCACTATGCGTCGCATGGAACGGAAGATGAGAGCGAACTCAACTTCGTCAAAGCAACGAACGAACCTGTTATGCTGCAGCATAACAGGTTCGTTCGTTGCTTTGACGAAGTTGAGTTTGACTATTACCCAGCATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCATGCTGGGTAATAGTCAAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGTTGACTATTACCCAGCATGGCCATTTATCCTGTGAACCAGATAAAAACTCTGCGTGCGCCGTCTTTCAGGTTGTCCATGGACAACCTGAAAGACGGCGCACCCAGAGTTTTTATCAACACCAGTTTAGGGTCGAGGGGTTAAGCCATTTAACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCGTTAAATGGCTTAACCCCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGGGGGTTAAGCCATTTAACGGGGGTGACCTCTCTGAATACTCCGGAACATAATGAAGTCTGACACCGCCACCAGTAACAAGTATTTTCACGTGAAAATACTTGTTACTGGTGGCGGTGTCAGACTTCATTATGTTCCTGTTACGGATAAGCAACGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCTCGTTGCTTATCCGTAACAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGTGTTACGGATAAGCAACGAGACGGAGTATTCAGAGAGGTCACATCAAACAGCAGGACGCCTAACATTGAGATGAAGCGTGCACGCTTCATCTCAATGTTAGGCGTCCTGCTGTTTGATGTGTGTGGGATTATTGCTGTCAATGAAACAACACAACAGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCGCTGTTGTGTTGTTTCATTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGAATGAAACAACACAACAGCGCGTGAGAAACAGGACGAAACTGAAGCAACAAACGGGACCGCCCCTTACAGTTACGGCTATATAGCCGTAACTGTAAGCGGCGGTCCCGTTTGTTGCTTCAGTGCTGTTGCCTGACTTTTAAGTTCTTCGTTGGTGAGGTTC46JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 11 2023研究论文乔君，等：大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响续表2引物名称R2-022GTF-022G-FTF-022G-RT-022G-FF1-023R1-023F2-023R2-023TF-023-FTF-023-RT-023-FF1-024R1-024F2-024R2-024TF-024-FTF-024-RT-024-FF1-025R1-025F2-025R2-025TF-025-FTF-025-RT-025-FT-PHB-FT-PHB-R1.3培养基及培养条件1.3.1培养基在LB培养基、M9培养基和PHB发酵培养基中加入卡那霉素（50 mg/L)、壮观霉素（50 m g/L)或氨青霉素（10 0 mg/L），维持筛选压力。1.3.2培养条件PHB发酵条件参见文献44。1.4生长曲线测定活化的大肠杆菌菌株分别接入LB和M9培养基中，于37、2 0 0 r/min培养,每隔2 h取样测定OD600,直至OD6o0基本稳定。1.5质粒、突变株和PHB生产菌株的构建15.1质粒的构建基因敲除中以pTargetF为模板构建pTargetF013-025系列质粒。以pTargetF013为例，使用引物TF-013-F/TF-013-R反向PCR扩增引物序列（5 3）AGCCATCCGTCATCCATAACCTGACAGAGACTTCACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCGTGAAGTCTCTGTCAGGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGACCTGACAGAGACTTCACGGATGGAATGGTAAGCAAGACACGTAGAGCAGGAAATGGCTTCAATACCAGGATAAACCGTACGGTTTATCCTGGTATTGAAGCCATTTCCTGCTCTACGCCTGTGGCTGTAACCAAATATGGATGCGACATCAACCCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCGGGTTGATGTCGCATCCAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGTGGATGCGACATCAACCCGGCACCGCAGAGAGACGACTTTAATCTCTCCAGGCTCGCCCAAATGCGTTCATAAGGCGCCTTATGAACGCATTTGGGCGAGCCTGGAGAGATTAGCTAATCAAGCGACTATCAAAGACACTGGCGATTGATATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCCGATATCAATCGCCAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGACACTGGCGATTGATATCGGAGAAGAATCGGTCACCTCGTTTTAGCAGCGAGTCCCGGCAACTACAAAAAAGCCACATGTGGCTTTTTTGTAGTTGCCGGGACTCGCTGCTAAAAAGGCAGTATTCAAAAAACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCCTGTTTTTTGAATACTGCCTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGAGGCAGTATTCAAAAAACAGGCAAGTCCCAACCATTCACAGAAACACCGTATGTCCCT获得质粒片段，再用凝胶纯化试剂盒纯化。纯化后的质粒片段用T4 DNA连接酶连接,将其转人大肠杆菌Turbo感受态细胞，37 复苏1h后涂布壮观霉素抗性平板,用T-013-F/T-R引物筛选菌落并测序验证质粒正确性。其他敲除质粒采用相同的方法和对应的质粒构建。1.5.2突变菌株的构建采用Crispr-Cas9双质粒无痕基因编辑技术敲除大肠杆菌MG1655基因组中的相关基因簇，该方法需要包含pTargetF系列质粒和供体DNA。p T a r g e t F系列质粒构建如1.5.1所述，供体DNA的获得以WQMO13的构建为例进行详细说明。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别用引物对F1-013/R1-013和F2-013/R2-013扩增获得上下游同源臂片段。获得的产物经DNA纯化食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期CTGCTTGTCAAACGCTCC47RESEARCHARTICLEQIAo Jun,et al:Absence of Key Biofilm Components Affect CellPerformances in Escherichiacoli回收试剂盒纯化后，以该上下游同源臂片段为模板,用引物F1-013/R2-013重叠PCR,再利用DNA纯化回收试剂盒纯化后，即得到供体DNA。将供体DNA(400ng)和pTargetF013(100 ng)混合后电转人MG1655/pCas感受态细胞中。复苏后涂布于含有卡那霉素和壮观霉素的平板,在30 下培养48 h,用引物F1-013/R2-013挑选突变株,并测序验证其正确性。其他突变株使用相同的方法构建。1.5.3PHB生产菌株的构建将携带基因PHB合成关键基因phaCAB的pBHR68质粒电转到野生型MG1655和突变株WQM013-020、WQ M 0 2 2 G、WQM023-025中,用引物T-PHB-F和T-PHB-R验证正确性。1.6镜检及膜通透性1.6.1结晶紫染色大肠杆菌细胞固定后，加人质量分数1%结晶紫静置30 s,无菌水冲洗后晾干,在光学显微镜下观察菌体形态。1.6.2胞外多糖染色采用单宁媒染染色法进行胞外多糖染色2 9 。大肠杆菌细胞在LB和M9固体培养基上培养2 4h，挑取单菌落并固定在载玻片上，加人品红溶液（0.3mL品红碱、9 0 mL体积分数5%苯酚、10 mL体积分数9 5%乙醇）染色3min，无菌水冲洗后加媒染液(2 g/L硫酸铝钾饱和溶液、0.3g/LFeCl3、1.5g/L 单宁体积比为5:2:3)染色3h，无菌水冲洗后用质量分数1%亚甲蓝处理30 s，无菌水冲洗晾干后在油镜下观察样品1.6.3膜通透性检测基-萘胺(NPN)法2 9.32 。细胞培养12 h后,收集菌体并洗涤2 次，菌体重悬于1.9 2 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中。细胞悬液中加入1 mmol/LNPN,使菌体浓度OD600为0.5，然后用荧光分光光度计测定荧光强度（激发和发射波长分别为350 nm和42 0 nm)。1.7PHB定量分析使用尼罗红染色法对产PHB菌株进行高通量筛选,PHB发酵结束后，离心收集菌体,加入TSE蔗糖缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、p H 7.5,2 0 g/d L 蔗糖溶液,2.5mmol/LNa-EDTA溶液），使其OD6oo为0.4,冰上孵育10 min，离心收集菌体,用1mmol/L氯化镁溶液重悬至相同菌体浓度。将3L尼罗红溶液(1mg/mLDMSO溶解）添加到1mL细胞悬液中,混匀后在37 避光孵育30 min,立即用酶标仪在37 下检测荧光强度，激发波长为48 5nm,发射48JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 2023波长为56 5 nm。1.8基因转录分析全转录组分析按已报道的方法执行2 9 。大肠杆菌MG1655和WQM018分别培养至对数中期，4、12 0 0 0 r/m in 收集菌体，磷酸缓冲液洗涤2 次后用液氮速冻。大肠杆菌MG1655基因组用于序列读取、比对和分析。RNA文库的提取、构建和测序委托苏州金唯智生物技术公司操作。原始转录组序列数据已上传到NCBISequenceReadArchive数据库(SRA）,项目序号为PRJNA603230。2结果与分析2.1大肠杆菌非必需生物膜组分筛选及突变株的构建为了考察去除非必需生物膜组分对菌株生长和表型产生的影响，作者选择大肠杆菌MG1655模式菌株为研究对象。首先查阅比对大肠杆菌MG1655基因组，筛选出非必需生物膜组分11个，分别是：菌毛、鞭毛、卷曲纤维、核心多糖、0-抗原、克拉酸、肠杆菌共同抗原、4型荚膜、纤维素、唾液酸和聚-1,6-N-乙酰葡萄糖胺。其中,菌毛、鞭毛和卷曲纤维属于大分子蛋白质聚合物类，其他8 种属于胞外多糖类。前期研究发现，去除大肠杆菌菌毛和ECA可以促进菌株生长并提高生产效率4。因此，作者分别敲除鞭毛、卷曲纤维、核心多糖、O-抗原、克拉酸、4型荚膜、纤维素、唾液酸和聚-1,6-膜通透性评价采用N-苯N-乙酰葡萄糖胺的11个操纵子，构建出突变株WQM013.WQM014.WQM015WQM016WQM017、WQM018、WQ M 0 19 WQ M 0 2 0、WQ M 0 2 2 G WQ M 0 2 3、WQM024和WQM025,见图1。2.2非必须生物膜组分缺失突变株的生长改变11个突变菌株分别在富营养的LB培养基和营养缺乏的M9培养基中培养，其生长曲线见图2。在LB培养基中，WQM018、WQ M 0 19、WQ M 0 2 0 和WQM023的生长速度和生物量不及对照菌株MG1655,涉及的组分为核心多糖、0-抗原、克拉酸和纤维素，说明这4种组分对菌株的生长至关重要，去除它们可能会造成生物膜变薄或破损，对菌株产生不利影响。其他突变株的生长与对照菌株相当,这可能是由于LB培养基中的营养比较丰富，不能明显体现出去除生物膜组分可节约能源和底物及对菌株的促进效果。在M9培养基中,WQM013、研究论文乔君，等：大肠杆菌生物膜关键组分缺失对细胞性能的影响WQM014、WQ M 0 16 和WQM024生长速度和生物量明显优于对照菌株，涉及组分鞭毛和唾液酸，这可能是由于M9培养基（基础培养基)营养匮乏，细菌组分鞭毛卷曲纤维核心多糖waaOwaaGwaaPwaaswaaBwaa0-抗原克拉酸4型英膜纤维素睡液酸葡萄糖酰胺聚-1,6-Fig.1Non-essential biofilm components in E.coli MG1655=MG1655(M9培养基)MG1655(M9培养基)突变株(M9培养基）+突变株（M9培养基）MG1655(LB培养其)MG1655(LB片养基)突变株（LB培养基）突变株(LB培养基）5543ao2一需要通过自身先合成必需氨基酸或其他关键物质用于鞭毛或唾液酸合成，而去除鞭毛或唾液酸后，细胞可以节约底物和能源用于生长。基因簇基因数突变株14WQM0137WQM01414WQM015食食食食食食食食会157WQM017OWawaaYwaaHCagmdbesGhesE besE yhiRwhio besy besBbeszbesc图1大肠杆菌MG1655的非必需生物膜组分55r突变株（LB培养基）44321WQM016waaLwaacwaafwaaD1411gm207WQMO22G9WQMO236WQM0244WQMO025MG1655(M9培养基)=MG1655(M9培养基)+突变株（M9培养基）+突变株（M9培养基）MG1655(LB培养基)+MG1655(LBJ养基)突变株(LB培养基）422WQM018WQM019WQMO020工4681012141618t/h(a)WQM013母MG1655(M9培养基)突变株(M9培养基）MG1655(LB培养基)5突变株(LB培养基）4321024681012141618t/h(e)WQM017+MG1655(M9培养基)突变株(M9培养基）MG1655(LB培养基)5突变株(LB培养基）42.4681012141618t/h(b)WQM014母MG1655(M9路养基)+突变株(M9培养基）eMG1655(LB培养基)5突变株（LB培养基）43224681012141618t/h(f)WQM018=MG1655(M9培养基)突变株（M9培养基）MG1655(LB培养基）)5突变株(LB培养基)2.4681012141618t/h(c)WQM015MG1655(M9路养基)+突变株(M9培养基）MG1655(LB培养基)+突变株(LB培养基）42246/h(g)WQM019-MG1655(M9养基)突变株（M9培养基）MG1655(LB培养转)5F+突变株(LB培养基）2.4681012141618/h(d)WQM016母MG1655(M9塔养基)+突变株(M9培养基）MGI655(LBJ培养基)5突变株（LB培养基）4o281012141618024681012141618t/h(h)WQM020+MG1655(M9路养基)突变株（M9培养店）MG1655(LB培养格)+突变株(LB培养基）32o124681012141618t/h(i)WQM022GFig.2Growth curves of mutants cultured in LB and M9 medium24.681012141618/h(j)WQM023图2突变株在LB和M9培养基中生长曲线24681012141618t/h(k)WQM024食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第11期24.681012141618t/h(1)WQM02549RESEARCHARTICLEQIAo Jun,e