厌氧菌代谢酸产物的气相色谱分析.doc

厌氧菌代谢酸产物的气相色谱分析
作者：顾淑萍　刘正　宋培智　 文章来源：上海口腔医学　

2008-6-5 16:15:38 　　　　　　 　【博客】 【论坛】 【投稿】 【打印】 【关闭】
［摘　要］　目的　探讨厌氧菌代谢有机酸色谱分析法的可靠性,为大量的临床分离的厌氧菌鉴定提供可靠方法。方法　利用气相色谱法对6种厌氧菌的国际参考菌株的代谢有机酸进行了定性定量测定。结果　60株细菌中,有48株细菌测到所有代谢有机酸,10株细菌测到主要代谢有机酸,2株细菌测到不应有的代谢有机酸,总符合率为97.67%。结论　代谢有机酸色谱分析法鉴定厌氧菌是一种可靠的方法。
［关键词］　厌氧菌;有机酸;气相色谱
　　厌氧菌因其生长缓慢、多数生化反应不活跃,用常规生化鉴定常有误差,而厌氧菌的代谢产物中常有特异的有机酸,故在厌氧菌的鉴定上已引入了代谢产物的定性定量测定,从而使其鉴定更加可靠。本实验对6种厌氧菌的代谢有机酸进行了检测和分析,以检验色谱法代谢产物测定的准确性,为鉴定临床分离的厌氧菌提供可靠的方法。
1　材料和方法
1.1　细菌及其培养
　　本实验所采用的6种厌氧菌为乳杆菌ATCC4646、粘放菌ATCC19246、韦荣菌SSMU2041、产黑色素类杆菌ATCC1312、核梭杆菌F11和消化链球菌ATCC27337(均由上海市口腔医学研究所龋病室提供)。将上述6种细菌(均为国际参考菌株)(每种10株)接种于厌氧菌液体培养基(卫生部上海生物制品研究所提供)37℃厌氧培养72h后,涂片检查并作生化试验鉴定为纯菌株后,调细菌A值(721分光光度计,上海第三分析仪器厂)为1,接种100μl于10ml PYG液体培养基中,37℃厌氧培养72h(对生长慢的细菌培养时间延长至7d)后,提取代谢有机酸产物。
1.2　标准有机酸配制
　　所用标准有机酸为色谱纯,均系上海化学试剂总厂生产。
　　挥发性有机酸：乙酸0.057ml,异戊酸0.109ml,丙酸0.075ml,戊酸0.109ml,已丁酸0.093ml,异己酸0.126ml,丁酸0.092ml,己酸0.125ml。以上试剂加蒸馏水至100ml,其中各酸的含量为10mmol/L。
　　非挥发性有机酸　85%乳酸0.088ml,丙二酸0.104g,草酸0.126g,琥珀酸0.118g。以上试剂加蒸馏水至100ml,其中各酸的含量为10mmol/L。
1.3　提取方法
　　挥发性有机酸：吸取2ml培养物于一带塞小试管中,加50%硫酸0.2ml、乙醚1ml盖紧塞子,来回倒转20次,使乙醚和培养物充分混匀,1000r/min离心10min,置试管于-20℃冰箱至试管底部水结冰,迅速倒出乙醚于另一试管,取1μl作色谱分析。
　　非挥发性有机酸：吸取1ml培养物于一带塞小试管中,加50%硫酸0.4ml、甲醇2ml盖紧塞子,55℃水浴过夜,取出试管加蒸馏水1ml、氯仿0.5ml,来回倒转20次充分混匀,1000r/min离心10min,吸取底部氯仿层1μl作色谱分析。
　　标准酸和空白培养基也用同样方法进行提取,取1μl作色谱分析。
1.4　色谱分析条件
　　Autosystem GC Chromatograph气相色谱仪,氢火焰离子检测器,PE1200色谱分析工作站;色谱柱为:毛细管柱,柱长30m、内径0.25mm、内涂Carbowax 20mol/L,液膜厚0.25μm;进样器温度250℃,柱温230℃,FID温度280℃;载气为氮气,压力12.4psi,氢气∶空气为30∶340ml/min。每个样本分析时间为10min。
1.5　数据处理及谱图制作
　　将样本注入进样器后,仪器自动采集数据并送到1200工作站积分处理并作出色谱图,其中记录各有机酸的出峰顺序、保留时间、峰高、峰面积百分比。将各菌株的谱图数据与标准酸的谱图数据输入电脑,并减去空白管的酸本底,算出各菌株的代谢有机酸产物的mmol值,以10mmol/L为标准定出主要酸产物(＞10 mmol/L)和次要酸产物(＜10 mmol/L)。参照Bergey系统微生物手册［1］和陈聪明［2］的鉴定方法,检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、己酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸。将各菌株的产酸谱与标准谱比较,得出符合率。
2　结果
　　除核梭杆菌中的次要酸产物丙酸未检出外,其它所有细菌的主要和次要酸产物均检测到,其含量见表1。检测出的代谢酸含量基本与标准一致(表2),有两株乳杆菌检测到己酸。各菌株的主要代谢有机酸色谱图见图1-6。
2008-6-5 16:15:38 　　　　　　 　【博客】 【论坛】 【投稿】 【打印】 【关闭】
表1　各细菌代谢有机酸产物的量(mmol/L)(n=10)
Tab 1. The amount of organic acid produced by 6 strains of bacteria

乳杆菌
粘放菌
产黑色素
类杆菌
韦荣菌
消化链
球菌
核梭
杆菌
乙酸
8.48
8.73
30.76
6.46
10.46
9.64
丙酸
-
-
-
3.76
-
-
异丁酸
-
-
0.97
-
0.29
-
丁酸
-
-
-
-
0.40
73.64
异戊酸
-
-
0.31
-
0.15
-
戊酸
-
-
-
-
-
-
异己酸
-
-
-
-
4.28
-
乳酸
18.51
10.01
3.30
1.45
-
20.98
草酸
-
-
-
-
-
-
丙二酸
-
-
-
-
-
-
琥珀酸
-
13.15
10.17
-
-
2.52

图1　乳杆菌非挥发性代谢有机酸
Fig.1 Non-volatile metabolic organic acid produced by lactic acid bacteria

图2　韦荣菌挥发性代谢有机酸
Fig.2 Volatile metabolic organic acid produced by verillonella 

图3　粘放菌非挥发性代谢有机酸
Fig.3 Non-volatile metabolic organic acid produced by actinomyces viscous

表2　各细菌代谢有机酸产物分析符合率
Tab.2 The coincidence of metabolic organic acids for 6 strains of bacteria
细菌
菌株数
完全符合
基本符合
不符合
菌株数
%
菌株数
%
菌株数
%
乳杆菌
10
8
80.00
0
0.00
2
20.00
粘放菌
10
4
40.00
6
60.00
0
0.00
产黑色素类杆菌
10
10
100.00
0
0.00
0
0.00
韦荣菌
10
10
100.00
0
0.00
0
0.00
消化链球菌
10
0
0.00
10
100.00
0
0.00
核梭杆菌
10
0
0.00
10
100.00
0
0.00
合计
60
32
53.33
26
43.33
2
2.33

完全符合:主要和次要酸产物全部检测到,且含量与鉴定标准一致;基本符合:主要和次要酸产物误差不超过一项;不符合:主要和次要酸产物误差两项以上,或出现不应有的代谢产物。

图4　产黑色素类杆菌挥发性代谢有机酸
Volatile organic acid produced by B.melaninogenicus

图5　消化链球菌挥发性代谢有机酸
Fig.5 Volatile metablic organic and produced by petustreptococcus

图6　核梭杆菌挥发性代谢有机酸
Fig.6 Volabile organic acid produce of by bacteroides nucleic acids
3　讨论
　　气相色谱法是50年代创立的一种新型的化学分离分析方法,其特点为高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度及应用范围广。约在50年代末、60年代初开始用于研究宇宙生命物质及微生物学。近年来由于计算机数据处理系统引入色谱分析仪,使气相色谱分析法能对微生物进行快速分类鉴定［3］。
　　本研究应用气相色谱分析法,对60株细菌的代谢有机酸产物进行了定性和定量分析。48株细菌能检测到所有代谢有机酸产物,其中32株细菌的各种有机酸产物的含量与鉴定标准一致;10株核梭杆菌的次要产物丙酸未检出;2株乳杆菌检出不应有的己酸,总符合率为97.67%,不符合率为2.33%。
　　本实验中的韦荣菌、产黑色素类杆菌、核梭杆菌、消化链球菌均为专性厌氧菌,生长条件苛刻,生长缓慢,且有些细菌生化反应不活跃,因此常规生化鉴定常有误差。而厌氧菌的代谢产物中具某种特异性的有机酸,如放线菌产生大量琥珀酸,核梭杆菌产生大量丁酸,丙酸杆菌产生大量丙酸。因此利用色谱分析法检测有机酸产物,对鉴别厌氧菌具有重要作用。本实验的结果(符合率97.67%)也证实色谱法的可靠性。
　　但色谱分析法检测的为代谢产物,常受营养状况、培养基中的杂酸、培养时间、接种菌量、进样量、色谱柱的分离效能、检测器的灵敏度等因素的影响。故在作细菌鉴定中应考虑到这些问题,可与其它细菌表型特征如形态、染色、生化反应特性综合起来,最后得出结论。
［作者简介］顾淑萍(1963-),女,主治医师
顾淑萍（上海第二医科大学附属第九人民医院口腔医学院口腔内科,上海　200011）
刘正（上海第二医科大学附属第九人民医院口腔医学院口腔内科,上海　200011）
宋培智（上海海军四一一医院口腔科，上海　200080）
［参考文献］
［1］　Sneath PHA,Mair NS,Sharpe ME，et al. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology［M］.Baltimore USA William & Wilkins Volume 1,1986，604.
［2］　陈聪明,王文凤.厌氧菌及其感染［M］.上海:上海医科大学出版社,1989，267.
［3］　周方,朱厚础.气相色谱法在微生物学和医学中的应用［M］.北京:科学出版社,1984，1.