资源描述
可溶性肝素结合性表皮生长因子促进表皮生长因子受体转运到细胞核
Nataliia V. Korotkevych*, Andrii Ju. Labyntsev, Denis V. Kolybo, Serhiy V. Komisarenko
分子免疫学系，乌克兰国家科学院生物化学，乌克兰基辅palladin研究所
摘要
大多数的表皮生长因子受体（表皮生长因子受体）的配体有能力诱导表皮生长因子受体易位到细胞核中，在细胞核中表皮生长因子受体作为一个重要的转录调控因子。可溶性肝素结合表皮生长因子（sHB-EGF）在许多类型的细胞是表皮生长因子受体（EGFR）的一种配体；然而，目前没有证据表明sHB-EGF有诱导EGFR核输入的能力。在此，我们证明了在这里，用sHB-EGF处理A431细胞导致EGFR核定位且是通过逆行途径发生这种定位。由共聚焦显微镜和免疫共沉淀分析表明，易位复合体包括配体和受体两种。染色质免疫沉淀实验表明在细胞核中细胞周期蛋白D1启动子区域与SHB-EG-EGFR复合物的关联，通过EGFR激酶抑制剂AG-1478的应用阻止止这种关联。根据所获得的数据表明，SHB-EGF同样对其它EGFR配体起作用，并能够诱导EGFR的核易位作为配体 - 受体复合物中酪氨酸磷酸化依赖性的一部分。
引言
肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）是EGF生长因子家族中的一员。它具有高亲和力的肝素和硫酸乙酰肝素[ 1 ]。HB-EGF的前体合成的I型跨膜蛋白（Pro HB EGF），它的分裂是通过胞外蛋白酶，导致sHB-EGF脱落。sHB-EGF介导旁分泌和促进生存、增殖和不同细胞类型迁移的表皮生长因子受体家族的受体ErbB1（EGFR）和ErbB4自分泌活化[ 2 ]。这些自分泌和旁分泌的sHB-EGF活动可以作为肿瘤促进因子。目前很清楚的知道可溶性HB-EGF和proHB-EGF作用方式是不相同的，HB-EGF一些生物活性是以可溶性形式被限制（如诱导EGFR自分泌活化的能力）。
配体结合到表皮生长因子受体导致表皮生长因子受体的激活，内化和进一步的循环，或者导致配体-受体复合物的溶酶体降解[3]。一些表皮生长因子受体成员如ErbB1 [ 4 ]，ErbB2[ 5 ]和ErbB3 [ 6 ]已以完整的形式在细胞核中检测出。这些受体的核定位也在不同的正常[ 7，9 ]或恶性细胞[ 10 ]中发现。所有ErbB蛋白含有核定位信号（NLS），核受体通过核孔复合体[ 11 ]运输需要这种信号。在细胞核中，这些蛋白可能通过直接与转录调控因子[ 12 ]结合来调节特定靶基因的转录。例如，核表皮生长因子受体作为一种转录因子，导致激活的基因需要高的增殖活动。当表皮生长因子被刺激后，EGFR转位到细胞核内与cyclin D1启动子近端结合后刺激其表达，引起细胞增殖[10]。有趣的是，EGFR本身缺乏DNA结合域，这就是为什么它会与其他的DNA因子如STAT3 STAT5结合需要EGFR的能力去激活特定基因[13,14]。
据研究报道表明HB-EGF前体被局限在人膀胱移行细胞癌的肿瘤细胞核中[ 15 ]。核proHB-EGF可在活性氧（ROS）[16]的作用下从细胞核输出。然而，目前暂时没有证据表明sHB-EGF的核定位，以及sHB-EGF诱导表皮生长因子受体核易位能力。在本研究中我们解决了这些问题并揭示了sHB -EGF/EGFR复杂的核周区转运。
材料和方法
细胞培养
A431细胞[ 17 ]是从乌克兰国家科学院放射实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所得到的，在RPMI-1640 L-谷氨酰胺培养基上进行细胞培养，添加10%的胎牛血清（FBS）和青霉素链霉素两性霉素B（σ-奥德里奇，密苏里，美国）。显微镜实验时，把细胞放在35毫米的盘子里盖上盖玻片接种过夜。
质粒结构
人的sHB-EGF和之前所描述的mCherry sHB-EGF重组质粒的构建。简单来说，这两种结构是基于pET28a质粒和大肠杆菌表达菌株BL21 DE3 Rosetta。编码来自U937细胞的HB-EGF的全长形式的DNA用于编码sHB-EGF的可溶性的扩增片段。扩增基因片段与用BamHI和XhoI酶切位点的表达载体pET28a合并。因此，基因工程的pET28a-SHB-EGF已获得。为了获得的pET-28amCherry-SHB-EGF，mCherry编码序列从质粒pmCherry（CLONETECH，USA）中扩增，在sHB-EGF的5’-端使用XhoI和PstI酶切位点酶切位点插入pET28a sHB-EGF，所有分子克隆试剂购自Thermo Scientific（MA，USA）购得。
pEGFR EYFP质粒由V. Verkhusha（艾伯特爱因斯坦学院，美国纽约）教授亲情提供，P23 EYFP质粒由J. Rędowicz教授（Nencki生物化学研究所，波兰华沙）亲情提供。pEGFR-EYFP 和 p23-EYFP质粒对A431细胞的转染用的是LipofectAMINE LTX（英杰公司，加利福尼亚州，美国）进行。
重组蛋白的生产
用于重组sHB-EGF和mCherry sHB-EGF生产，在标准化培养协议条件下我们用大肠杆菌表达菌株BL21 DE3 Rosetta。过夜培养物稀释1:20与含有2％葡萄糖（Sigma-Aldrich公司，密苏里州，美国）LB培养基中培养，达到37°C，OD 600 = 0.5–0,7的细胞密度。经IPTG诱导后，细胞在最佳温度培养3–3.5小时即可。细菌重组蛋白的纯化根据制造商的建议通过科学和生产企业的“烯胺”（乌克兰基辅）以Ni-NTI琼脂糖层析（Qiagen公司，林堡，荷兰）进行。在变性条件下用烯酰胺凝胶电泳验证重组蛋白的纯度。
sHB-EGF 和mCherry-sHB-EGF的增殖活动
先前的研究已经表明重组蛋白sHB-EGF和mCherry sHB-EGF活性[ 18,19 ]，总之，对人类的sHB-EGF和mCherry sHB-EGF 的增殖活动用MTT法与小鼠成纤维细胞BALB/c 3T3（乌克兰实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所国家科学院）进行评价。重组蛋白能够促进3T3细胞增长和细胞迁移，与未经处理的细胞相比，高达30至35%。用EGFR激酶活性抑制剂AG1478（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）和基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂GM6001（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）证明SHB EGF作用特异性。GM6001是用来抑制通过体外培养的细胞自分泌sHB-EGF生产。结果表明，mCherry sHB-EGF能够在3T3细胞和A431细胞中分别诱导ERK1 / 2（# 4370，细胞信号技术，美国）和p38丝裂原活化蛋白激酶（sc-7149、圣克鲁斯生物、美国）磷酸化。通过共聚焦显微镜用抗表皮生长因子受体（e2760，西格玛奥德里奇，密苏里，美国）和二次FITC标记的抗体（f5387，西格玛奥德里奇，密苏里，美国）证实了mCherry sHB-EGF在A431细胞表面特异性结合的受体的能力。
细胞组分的分离和免疫印迹分析
在这项研究中使用的抗体为抗核纤层蛋白B1（# 33–2000，Invitrogen公司，美国），抗EGFR单克隆抗体（e2760，西格玛奥德里奇，密苏里，美国），抗肌动蛋白单克隆抗体（8226，图，
美国）、抗GST（a7340，西格玛奥德里奇，密苏里，美国），ERK 1 / 2（sc-135900，圣克鲁斯生物技术，美国），total p38（sc-7149、圣克鲁斯生物、美国）二过氧化物酶共轭抗体抗兔IgG（a0545）和抗小鼠IgG（a9044）都是从Sigma奥德里奇公司获得（密苏里，美国）。
A431细胞血清饥饿24小时并在不同的时间用SHB EGF（500纳克mL-1）刺激它。在使用AG1478时，在加入sHB-EGF 5分钟前用该试剂进行预处理。通过细胞膜裂解缓冲液（10 mM HEPES，1,5毫米氯化镁，10毫米氯化钾，0.5 mdtt，0.05% NP40（所有从西格玛奥德里奇，密苏里，美国）刺激并破坏细胞。，pH值7.9，Halt ProteaseInhibitor Cocktail(Thermo Scientific，美国)，并在冰上敷10分钟。细胞通过一个25号针头20次并离心1500g 5分钟以使细胞核沉淀。上清液再以13000 g的最大速度离心20分钟，直至上清液没有细胞核。用细胞膜裂解缓冲液将细胞核清洗3次，以除掉来自细胞质膜的任何杂质。排除非核EGFR核提取物污染的可能性, 非刺激和刺激SHB EGF 的A431细胞与非刺激和SHB EGF刺激A431细胞非核部分分别混合。然后，细胞核再以最大速度离心并用细胞膜裂解缓冲液再洗三次。把分离的细胞核悬浮在细胞核裂解缓冲液中（5 mM HEPES，1,5毫米氯化镁，0,2 mm EDTA，0,5毫米DTT，26%甘油，300 mM NaCl）然后用简单的超声帮助核溶解并提取核蛋白。核裂解液以13000g速度离心20分钟后进行收集。蛋白质浓度用Bradford法[ 20 ]测定。然后样品与Laemmli样品缓冲液[ 21 ] 混合以950℃的温度加热15分钟。样品进行8%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE随后转移到硝酸纤维素膜，膜用单克隆或多克隆抗体检测随后用辣根过氧化物酶标记抗体。免疫反应蛋白条带用增强化学发光试剂（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）进行检测。
间接免疫荧光法和共聚焦显微镜技术
细胞低密度接种于盖玻片上在不同的阶段1% BSA / PBS在溶液中用sHB-EGF（1.5μg/ml）或mCherry sHB-EGF（5μg/ml）处理，用4%多聚甲醛溶液固定（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）。通过MTT法测定重组sHB-EGF最佳浓度。共聚焦显微镜染色的mCherrysHB- EGF最佳浓度通过对A431细胞的流式细胞仪分析来确定。在AG1478抑制剂的应用情况下，在sHB-EGF或mCherry sHB-EGF加入前将细胞预处理5 min。细胞核染色用Hoechst33342（奥德里奇，密苏里，美国）。有细胞的玻璃板安装到DABCO /PVA固定液（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）中，用LSM 510 META激光共聚焦扫描显微镜（Carl Zeiss，蔡司，德国）进行分析。图像分析是用斐济软件[ 22 ]完成的。图像相当于是整体面板标准化的工具。接下来，把比例尺和Z-Stack协议栈的深度添加到图像。如果需要的话把ROI（感兴趣区域）剪短，把他们的位置进行标记。其次，渠道分为单独的图像和定位分析用RG2B插件计算。
染色质免疫沉淀法（芯片）
兔血清从完整的苏联金吉拉兔子中获得，严格按照国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南建议。该协议是由委员会按乌克兰国家科学院帕拉金生化研究所动物实验的行为准则（协议# 9 25.10.2011）批准的。
A431细胞接种于五个10厘米的碟子上，血清饥饿24h和用SHB EGF（500纳克毫升-1）刺，GST sHB-EGF（1000纳克毫升-1）或0.01%过氧化氢刺激1小时。在AG1478或PAO（氧化苯胂）（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）的应用中在加入sHB-EGF或GST sHB-EGF之前细胞在抑制剂中预处理5分钟，在获得前细胞用1%甲醛40℃处理10分钟DNA的交联蛋白，细胞刮片，冷PBS洗涤，悬浮在500μL的低渗缓冲液中（10 mM Tris-HCl，pH值7.4，10毫米氯化钾，1 mM DTT），通过一个25号针头20次。核沉淀，悬浮在200μ
SDS裂解缓冲液（含1% SDS、EDTA 10毫米、50毫米Tris-HCl，pH 8和蛋白酶抑制剂），然后超声两次，每次30s，在冰上冷却急速分离。离心后，用免疫沉淀缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH值8.0150 5毫米的NaCl，mmedta，np40 0.5%）按1:10稀释上清液。得到的重组金黄色葡萄球菌的蛋白质正如前面所描述的 [23 ]。蛋白质的Sepharose CL-6B共轭协议（奥德里奇，密苏里，美国）从文章[ 24 ]修改。细胞裂解液再次清除是通过完整的兔多克隆血清在40℃培养1h，并用蛋白A进一步培养1h。清除抗原与抗EGFR单克隆培抗体、抗GST抗体培养，或完整的兔多克隆血清过夜。
免疫沉淀复合物的收集是通过添加蛋白A琼脂糖在40℃条件下气泡2hat。免疫沉淀用缓冲液洗一次（150 mM NaCl，50 mM Tris—盐酸，pH值为8，0.1%的SDS，0.5%脱氧胆酸钠、1% NP40），在高盐中洗一次（500mM NaCl，1% NP40，0.1% SDS，50 mM Tris-HCl，pH 8）在TE缓冲液洗两次（10毫米，Tris-HCl，pH值8，1 mmedta）。球状物然后用核糖核酸酶（50 mg mL-1）在37°C条件下处理30分钟，65°C加热6h时的交叉连接被打乱，然后GeneJET DNA纯化试剂盒提取（Thermo Scientific，MA，美国）。免疫细胞周期蛋白D1启动子的特异性序列通过PCR上游引物(5’-GAG GGG ACT AAT ATT TCC AGC AA-3’)和下游引物(5’-TAA AGG GATTTC AGC TTA GCA-3’)来形成。
定量分析与在斐济软件凝胶工具箱[ 22 ]进行。之前的分析是在没有斐济工具箱的背景下完成的，数据图是Excel 2007（微软公司，美国）制作的。最后的图片用矢量绘图工具（Adobe公司，美国）进行整理。
结果
SHB EGF诱导的EGFR核输入
我们使用过表达的EGFR A431细胞系，研究核用SHB-EGF处理EGFR的反应表现。A431细胞被增强型黄色荧光蛋白（EGFR-EYFP）标记的质粒编码EGFR转染，通过激光共聚焦荧光显微镜，在用sHB-EGF处理的A431细胞核周区域发现荧光蛋白融合的EGFR（图1）。从处理和未处理A431细胞得到的核和细胞质组分通过Western印迹分析与抗EGFR单克隆抗体研究。细胞质组分的纯度由α肌动蛋白富集的控制，而核分数的纯度由核纤层蛋白B1富集的控制。这两个部分没有检测到交叉污染。我们发现，核表皮生长因子在一个时间依赖性受体水平增加对sHB-EGF的处理做出反应。蛋白印迹分析显示在sHB-EGF处理A431细胞后大量的表皮生长因子受体的积累在在30-45分钟内。此外，AG1478，EGFR激酶抑制剂，防止表皮生长因子受体在表皮生长因子刺激下的核转位（图2）。有少量的受体在核部分发现，尽管没有额外的配体，这可能是由于自分泌刺激产生。
图1，表皮生长因子受体在SHB EGF刺激A431细胞下的亚细胞定位。表皮生长因子受体的免疫荧光定位是为了响应浓度1.5微克/毫升sHB-EGF处理30分钟。（蓝色，细胞核；绿色，EGFR-EGFP融合蛋白）AG1478-EGFR酪氨酸激酶抑制剂。斐济软件进行共定位数据分析，白色刻度条对应10微米。
图2.用sHB-EGF处理A431细胞后，细胞核和细胞质组分与定位。无核和有核的细胞提取物在没有sHB-EGF进行处理或是EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478存在的情况下进行免疫印迹分析。通过在sHB-EGF处理下激酶抑制剂AG1478抑制A431细胞中EGFR核定位来降低表皮生长因子受体活性。
SHB EGF和EGFR移位到核膜是有限的
为了探讨在细胞内转运到核膜期间HB-EGF和EGFR在细胞内形成复合物与受体的能力，采用mCherry荧光标记sHB-EGF（mCherry sHB-EGF）。A431细胞由质粒pEGFR EYFP转染，然后用mCherry sHB-EGF进行处理。Hoechst 33342用于使核的局部化。这个配体-受体复合物（黄色信号）在核周区发现，在Z-Stack图像上为绿色（EYFP）和红色（mCherry）的重叠信号（图3）。这一数据表明sHB-EGF与EGFR在转运到核膜过程中相互作用。
图3.EGFR与sHB-EGF互动与复合物的亚细胞定位，Z-stack的共聚焦图像。用pEGFR EYFP转染A431细胞用mCherry sHB-EGF刺激的30分钟。（mCherry sHB-EGF（红色）；EGFR-EYFP（绿色），SHB EGF/EGFR配体-受体复合物（黄色））白色刻度条对应10微米。
sHB-EGF逆运行易位到细胞核
我们使用的共定位实验研究探讨SHB EGF诱导的EGFR核转运的细胞内机制。A431细胞用编码EYFP融合重要否认COPI囊泡膜蛋白p23的质粒载体转染。这种蛋白质在顺式高尔基网络（CGN）中非常丰富并通过早期分泌途径持续循环 [ 25 ]。然后这些细胞用mCherry-SHB-EGF处理并研究mCherry信号在CGN-ER膜上的存在。mCherry-sHB-EGF与p23-EYFP的共定位表明了SHB EGF/EGFR配体-受体复合物通过CGN-ER膜转位到细胞核内（图4）。mCherry和EYFP荧光信号的最强共定位用mCherry sHB-EGF处理A431细胞后60-90分钟就以已发现。这个数据表明，SHB-EGF诱导的EGFR核易位通过CGN-ER膜运行，可能通过被膜小泡的途径，也被称为逆行运输途径。
探讨sHB-EGF诱导运输SHB EGF/EGFR复合物到CGN-ER膜时表皮生长因子受体激酶的作用，细胞EGFR激酶抑制剂AG1478预处理。如图4，右面板显示，mCherry sHB-EGF转运到CGN-ER膜受到抑制，但不能完全阻断AG1478在处理60 min后。COPI介导的EGFR到细胞核中的通路，至少部分是EGFR激酶独立。
图4. F在A431 细胞中的mCherry-sHB-EGF 和CGN-ER membranes随时间变化的共定位。细胞被P23 EYFP转染并在不同的时间段用sHB-EGF处理. sHB-EGF处理60分钟后加入AG1478（mCherry sHB-EGF（红色），CGN-ER膜（绿色）；mCherry sHB-EGF与CGN-ER膜共定位（黄色和白色））使用斐济软件共定位数据计算。白色刻度条对应5微米。
sHB-EGF是针对核作为EGFR / sHB-EGF配体受体复合体的一部分
周期蛋白D1基因的启动子区被认为是最重要的表皮生长因子受体的核目标[10]之一。我们用芯片检测探讨通过cyclin D1启动子sHB-EGF刺激表皮生长因子受体的相互作用。为此，SHB EGF处理的细胞的细胞核进行超声震荡，经过破坏的有特异性抗表皮生长因子受体单克隆抗体染色质沉淀，cyclin D1的启动子区进行PCR扩增。非免疫兔多克隆抗体用于负控制。如图5a所示，用sHB-EGF（500纳克毫升-1）刺激A431细胞后核受体被发现与内源性cyclin D1启动相关。
通常情况下，核表皮生长因子受体的水平增加为了响应细胞用活性氧、热辐射或顺铂[ 26 ]的处理。因此，我们用0.01%的H2O2作为EGFR易位到细胞核阳性对照处理A431细胞。如图5b所示，sHB-EGF诱导表皮生长因子受体核进口类与过氧化氢相似。EGFR激酶抑制剂AG1478阻止EGFR与cyclin D1启动子在sHB-EGF处理后交互作用（图5c），但并不能完全抑制。这一观察是按照图4中所示的数据，表明配体驱动的表皮生长因子受体关联与cyclin D1启动子区，至少部分，是激酶独立的。
上述数据表明，sHB-EGF被运送到细胞核与表皮生长因子受体相联合，在这里可以检测到有一部分的配体-受体复合物。我们进行芯片检测，根据配体和受体的相互作用在细胞核内检测sHB-EGF与表皮生长因子受体的结合。A431细胞用谷胱甘肽S-transferase-fused sHB-EGF (GST-sHB EGF)进行处理或与单独用GST（阴性对照）。EGFR激酶(AG1478)的抑制剂或内吞作用（phenylarsine oxide，PAO）的抑制剂用来阻止内化表面表皮生长因子受体。A431细胞的核裂解物进行芯片检测利用GST sHB-EGF特异抗体，发现sHB-EGF留存在EGFR上，当EGFR与cyclin D1启动相关时EGFR/GST-sHB-EGF复合物与抗GST抗体的沉淀导致在GSTsHB-EGF处理后的A431细胞中的cyclin D1启动子区域放大，但是当细胞只用GST或GSTsHB-EGF在AG1478和 PAO前面处理，则启动子区域未显示（图6）。
图5.抗表皮生长因子受体单克隆抗体的染色质免疫沉淀。A、B图，EGFR随着sHB-EGF (A) 和H2O2 (B)处理的核定位。sHB-EGF的处理增强核EGFR和Cyclin D1基因启动子区的结合。在sHB-EGF的处理下EGFR的活性通过激酶抑制剂AG1478抑制EGFR与A431细胞中cyclin D1的启动子结合的向下调节。
图6. 染色质免疫沉淀和抗GST抗体识别GST sHB-EGF核定位。表皮生长因子受体活性的激酶抑制剂AG1478和内吞作用抑制剂（PAO）在A431细胞中抑制GST sHB-EGF与cyclin D1启动子关系的向下调节。输入核DNA。
讨论
HB-EGF的生物活性通常归因于其可溶性形式，表现在细胞表面结合到EGFR或ErbB4。ProHB-EGF已经证明在细胞核内定位，但作者描述了其核定位独立于结合受体[ 15 ]。本研究首次表明，表皮生长因子受体的核易位可以在宫颈癌A431细胞通过诱导HB-EGF的可溶性形式。使用蛋白印迹分析显示，表皮生长因子受体的配体依赖性核转运发生在30-60分钟后，超过用sHB-EGF处理的细胞。EGFR激酶抑制剂AG-1478的使用，防止核部分表皮生长因子受体得出现（图2）。然而，少量的EGFR在未经处理的A431细胞中被发现，可能是由于EGFR自分泌刺激[ 27 ]。
根据获得的数据，图5表明sHB-EGF刺激核的EGFR能与细胞核中的细胞周期蛋白D1的启动子区域相互作用，我们的研究表明，细胞核的EGFR与sHB-EGF处理后的细胞cyclin D1启动子区相关（图5A），该联系由EGFR激酶抑制剂AG-1478的使用来阻止（图5C）。在未受刺激的细胞中扩增信号使我们得出结论：核受体免疫印迹法在未刺激的细胞检测到少量的EGFR（图2）不能与cyclin D1启动子区相互作用。另一方面，可见PCR扩增带表明了非刺激细胞AG-1478治疗证实了以前的研究结果，在表皮生长因子受体可以被转运到细胞核中，以响应于抑制酪氨酸激酶依赖的信号转导通路[28]。
众多的EGFR配体可以转运到细胞核与受体的关系相关联。例如，在MDA-MB-468细胞[ 10 ]的核中检测出EGF/EGFR蛋白复合物。我们结果表明sHB-EGF运送到核膜作为sHB-EGF / EGFR配体—受体复合物的一部分以酪氨酸磷酸化的方式与cyclin D1启动子结合。核受体及相关配体的生物学作用还有待进一步研究；我们假设sHB-EGF作为转录调控因子可以保持EGFR在配体-受体复合物中合适构象。
很难想象，一个完整的膜嵌入表皮生长因子受体逃过脂质
双分子层进入细胞核，最近的研究提供了一个表皮生长因子受体转运到细胞核通过逆行贩运[ 29 ] 的全面的跨膜模型，我们发现sHB-EGF驱动EGFR通过从细胞表面到细胞核的途径的CGN-ER膜，因此，在整个转运的途径中，一直保持膜的嵌入形式（图4）。SHB EGF/EGFR复合型的在核膜上的共定位证实了这样的观点，EGFR在核周（图1和3）以膜核活动的嵌入式实现。由于抑制表皮生长因子受体激酶仅部分地减少sHB-EGF -表皮生长因子受体复合物在CGN ER膜上的共定位，我们认为某些表皮生长因子受体激酶独立的机制参与sHB-EGF刺激逆行EGFR交通。sHB-EGF/EGFR复合物与cyclin D1启动子进一步的核结合被AG-1478完全抑制。酪氨酸激酶在这个结合中似乎发挥了关键的作用。
表皮生长因子受体家族成员在信号转导中起着重要的作用。然而，表皮生长因子受体激酶也具有一些不是很典型的功能，如转录调控，脱氧核糖核酸的合成和细胞核修复[ 30 ]。众所周知它是表皮生长因子受体家族促进细胞存活的核易位与增强抗辐射，化疗和抗表皮生长因子受体疗法相关[ 31 ]。可溶性配体在肿瘤细胞中增加核生长因子受体的能力可以解释所获得的抗肿瘤药物。进一步的研究旨在降低核表皮生长因子受体的水平可能重要的是抗表皮生长因子受体激酶靶向药物化疗，电离辐射等的抗性。
致谢
作者感谢来自艾伯特爱因斯坦医学院（美国）教授Vladislav verkhusha好心提供pEGFR EYFP质粒和科实验生物研究所（波兰）教授Jolanta Rędowicz好心提供P23 EYFP质粒。感谢生物化学研究所（乌克兰）教授Marina Skok和Bioelectrics弗兰克·里迪研究中心，奥多明尼昂大学（美国）Iurii Semenov教授的有益建议和合理的意见。
作者的贡献
构思和设计实验：NVK AJuL DVK
进行实验：NVK
数据分析：NVK.
贡献的试剂/材料/分析工具：NVK AJuL
写文章：NVK AJuL DVK SVK.
引用
1. Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, Fiddes JC, Klagsbrun M. 与表皮生长因子相关的巨噬细胞样细胞分泌的肝素结合生长因子。科学.1991；251：939——936。发表于：1840698
2. Higashiyama S, Nanba D. ADAM介导的受体串扰HB-EGF的胞外域脱落。物理学报. 2005; 1751: 110–117。关键词：10.1016/j.bbapap.2004.11.009发表于：16054021
3. Roepstorff K, Grandal MV, Henriksen L, Knudsen SLJ, Lerdrup M, Grøvdal L, et等。Traffic Cph Den. EGFR配体的受体内吞分选的不同影响。2009；10：1127——1115。关键词：10.1111 / j.1600-0854.2009.00943 X。
4. Marti U, Burwen SJ, Wells A, Barker ME, Huling S, Feren AM等。表皮生长因子受体在肝细胞核中的定位。中华肝脏病杂志Baltim马里兰州1991；13:15–20。
5. Xie Y, Hung MC.p185neu酪氨酸激酶和转录激活其关联的核定位。Biochem Biophys Res Commun。1994；203：1598——1589。发表于：7945309
6. Bueter W, Dammann O, Zscheppang K, Korenbaum E, Dammann CEL.胎儿内皮ErbB受体-炎症相关的新生儿疾病的潜在联系点。细胞因子。36：2006年；267–275。DOI号：容易j.cyto.2007.02.002 pmid：17379533
7. Zscheppang K, Korenbaum E, Bueter W, Ramadurai SM, Nielsen HC, Dammann CEL. erbB受体在II型肺上皮细胞的老鼠二聚和共同本地化，本地化。Pulmonol杂志。2006年：1205–1212；41。DOI：10.1002 / ppul.20518 pmid：17063476
8. Thompson M, Lauderdale S, Webster MJ, Chong VZ, McClintock B, Saunders R,等。ErbB2和ErbB4 ErbB3在非人类的灵长类动物大脑广泛表达。脑研究。2007;1139: 95–109. doi:10.1016/j.brainres.2006.11.047 PMID: 17280647
9. Raabe TD, Deadwyler G, Varga JW, Devries GH. 神经调节素异构体和髓鞘神经胶质细胞ErbB受体的定位。Glia. 2004; 45: 197–207. doi: 10.1002/glia.10311 PMID: 14730713
10. Lin SY, Makino K, Xia W, Matin A, Wen Y, Kwong KY,等。.表皮生长因子的核定位和作为转录因子的潜在新作用。自然细胞生物学。2001; 3: 802–808. doi: 10.1038/ncb0901-802 。PMID: 11533659
11. Hsu S-C, Hung M-C. 一种新的三方核定位序列在表皮生长因子受体家族中的表征，J Biol Chem. 2007; 282: 10432–10440. doi: 10.1074/jbc.M610014200 PMID: 17283074
12. Planque N. 核转运的分泌因子和细胞表面受体：新途径来调节细胞增殖和分化，并参与癌症。细胞通讯信号系统。2006; 4: 7.doi: 10.1186/1478-811X-4-7 PMID: 17049074
13. Lo H-W, Hsu S-C, Ali-Seyed M, Gunduz M, Xia W, Wei Y,等。EGFR和STAT3在iNOS的激活的核相互作用。癌细胞。2005; 7: 575–589. doi: 10.1016/j.ccr.2005.05.007 PMID: 15950906
14. Hung L-Y, Tseng JT, Lee Y-C, Xia W, Wang Y-N, Wu M-L,等核表皮生长因子受体与信号转导子相互作用与转录激活因子5（STAT5）在活化Aurora-A基因表达。核酸研究，2008; 36: 4337–4351. doi: 10.1093/nar/gkn417 PMID:18586824
15. Adam RM, Danciu T, McLellan DL, Borer JG, Lin J, Zurakowski D,等。对肝素连接表皮生长因子样生长因子前体的核形式是侵袭性移行细胞癌的特征。Cancer Res. 2003; 63: 484–490. PMID: 12543806
16. Kim J, Adam RM, Freeman MR. 转运核肝素结合表皮生长因子进入一个表皮生长因子受体依赖的自分泌环进行氧化应激反应。Cancer Res. 2005; 65: 8242–8249. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-0942 PMID:16166300
17. Giard DJ, Aaronson SA, Todaro GJ, Arnstein P, Kersey JH, Dosik H,等。人体肿瘤的体外培养：从一系列实体瘤中获得的细胞系的建立。J Natl Cancer Inst. 1973; 51:1417–1423. PMID: 4357758
18. Korotkevich NV, Kolibo DV, Labyntsev AJ, Romaniuk SI, Komisarenko SV. 重组人肝素结合表皮生长因子及其在生物技术中的应用前景。Biotechnol Acta. 2010; 3: 44–53.
19. Korotkevich NV, Labyntsev AJ, Kolibo DV, Komisarenko SV. 获得和重组可溶性人HB-EGF荧光衍生物的表征。生物工程学报。2014; 7: 46–53
20. Bradford MM. 一种快速、灵敏的微量利用蛋白染料结合定量分析蛋白质的方法。Anal Biochem. 1976; 72: 248–254. doi: 10.1016/0003-2697(76)90527-3 PMID: 942051
21. Laemmli UK. 对T4噬菌体头部的装配过程中结构蛋白裂解，自然，1970; 227: 680–685. PMID: 5432063
22. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T,等。斐济：一个开放源代码生物图像分析平台。NAT的方法。2012; 9: 676–682. doi: 10.1038/nmeth.2019PMID: 22743772
23. Oliinyk ES, Kolibo DV, Kaberniuk AA, Labyntsev AJ, Korotkevich NV, Romaniuk SI,等
从金黄色葡萄球菌蛋白得到的功能性片段d-e-a-a *表达与克隆。生物工程学报。2009; 2: 59–68.
24. Nakane PK, Kawaoi A. 过氧化物酶标记抗体。一种新的共轭方法。J Histochem Cytochem
Off J Histochem Soc. 1974; 22: 1084–1091. PMID: 4443551
25. Nickel W, Sohn K, Bünning C, Wieland FT. P23，主要COPI囊泡膜蛋白组成周期通过早期分泌途径。Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94: 11393–11398. PMID:9326620
26. Dittmann K, Mayer C, Fehrenbacher B, Schaller M, Raju U, Milas L,等。辐射诱导表皮生长因子受体核进口与激活的脱氧核糖核酸依赖性蛋白激酶。J Biol Chem. 2005; 280: 31182–31189. doi: 10.1074/jbc.M506591200 PMID: 16000298
27. Kim J, Jahng WJ, Di Vizio D, Lee JS, Jhaveri R, Rubin MA,等。磷脂酰肌醇激酶介导的pikfyve EGF受体转运到细胞核。Cancer Res. 2007; 67: 9229–9237. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-1333 PMID: 17909029
28. Wheeler DL, Dunn EF, Harari PM. 了解耐药表皮生长因子受体抑制剂对未来治疗策略的影响。Nat Rev Clin Oncol. 2010; 7: 493–507. doi: 10.1038/nrclinonc.2010.97 PMID:20551942
29. Wang Y-N, Hung M-C. 表皮生长因子受体家族的核功能及细胞内转运机制。Cell Biosci. 2012; 2: 13. doi: 10.1186/2045-3701-2-13 PMID: 22520625
30. Dittmann K, Mayer C, Kehlbach R, Rodemann HP. 辐射诱导的EGFR内化Caveolin-1与核受体相关的运输和激活的DNA-PK的联系。Mol Cancer. 2008; 7: 69. doi: 10.1186/1476-4598-7-69 PMID: 18789131
31. Brand TM, Iida M, Luthar N, Starr MM, Huppert EJ, Wheeler DL. 核表皮生长因子受体在肿瘤
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