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实验10 细菌计数
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一、显微镜直接计数法
【原理】
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌板)，于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、直观的方法。该法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，目前国内外常用的计菌板有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌板以及Hawksley计菌板等，血球计数板适用于菌体较大的酵母菌或霉菌孢子的计数，后两种计菌板适用于一般细菌的计数。这几种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜。这里介绍血球计数板方法计数酵母菌数量。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分为16个中方格(四角的四个大方格)，每个中方格又分25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格(中央的一个大方格)，而每个中方格又分成16个小方格，即计数区都由400个小方格组成(图1-3-12)。

图1-3-12 血细胞计数板构造
计数区（一个大方格）边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。
已知：1ml体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3
所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4×106个小方格 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数
＝4×106×每个小格中细胞平均数×菌液稀释倍数。
＝5×104×5个中格中细菌数×菌液稀释倍数（25个中方格）
＝4×104×4个中格中细菌数×菌液稀释倍数（16个中方格）
【试剂与器材】
1．菌种 酵母菌。
2．器材 显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm×22mm)、吸水纸、无菌毛细滴管、擦镜纸、生理盐水等。
【操作步骤】
1．制备菌悬液 视待测菌液浓度，加无菌生理盐水适量稀释(斜面一般稀释到10-2)，以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。
4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光栅并减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格(即100小格)的菌数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2~3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，按公式计算出每ml菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，洗净计数板后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
【计算】
每ml菌悬液中含有细胞数
＝每个小格中细胞平均数×4×106×菌液稀释倍数。
＝5个中格中细菌数×5×104×菌液稀释倍数（25个中方格）
＝4个中格中细菌数×4×104×菌液稀释倍数（16个中方格）
【注意事项】
1．向计数板中加样时，应摇匀菌液，计数室内不可有气泡。
2．不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
3．显微镜的光线强弱应调节适当，以免光线偏向一侧，而看不清计数板上的横竖线。
4．计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板，不可用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
5．若计数的是病原性细菌，需经50g/L的石炭酸溶液浸泡后，再进行清洗。
【评价】
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果不能区分细菌的死活。但可以结合活菌染色等方法计数活菌。
二、平板培养计数法
【原理】
平板培养计数是根据微生物在高度稀释条件下，其在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个细菌繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个细菌。计数时，首先将待测样品进行系列稀释，尽量使样品中的细菌分散开，使成单个存在(否则一个菌落就不只代表一个细菌)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由一个细菌生长繁殖形成单个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的菌数。
【试剂与器材】
1．样品 尿液或水样。
2．培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
3．器材 无菌生理盐水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
【操作步骤】
1．样品稀释液的制备 准确称取待测样品10ml，放入装有90ml无菌生理盐水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使细菌分散，静置20S～30S，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌生理盐水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌生理盐水的试管中，也吹吸3次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
2．计数细菌数 平板培养计数法有平板倾注培养法和平板涂布培养法两种。
(1)平板倾注培养法：将无菌平板编上10-1～10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各1ml放入编号10-8的3个平板中，再吸取1×10-7稀释液各1ml放入编号10-7的3个平板中(由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换)。然后在每个平板中分别倒入已熔化并冷却至45℃～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在35℃～37℃下培养24h～48h，菌落长出后计数。
(2)平板涂布培养法：先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂布均匀，每个稀释度用一个无菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂布时，也可以不更换刮铲。将涂布好的平板平放于桌上20min～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置35℃～37℃，培养24h～48h，计数菌落。
(3)定量培养法：用0.001ml的定量接种环取尿液，在血琼脂平板上作均匀涂布，然后置于35℃～37℃培养18h～24h，计数菌落。
【计算】
1．平板倾注培养法 每ml菌液中的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
2．平板涂布培养法 每ml菌液中的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
3．定量培养法 每ml尿液中的菌数＝平板上菌落数×（1/接种环含尿量（ml））
＝平板上菌落数×1000
4．不同稀释度平均菌落数的确认（表1-3-1）。
(1)选取平均菌落数在30～300之间的报告。如例1。
(2)两个相邻稀释度菌落平均数均在30～300之间，则计算其比值。若比值<2 ，应报告两个稀释度的平均菌落数，如例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如例3、例4。
(3) 所有稀释度平均菌落数均大于300，应按最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告，如例5。
(4) 所有稀释度平均菌落数均小于30，应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告，如例6。
(5) 所有稀释度均不在30～300之间，应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告，如例7。
(6) 若所有稀释度均未见菌落，则报告小于10，而不报告0。如例8。
表1-3-1稀释度选择及菌落数报告方式
不同稀释度的平均菌落数
10-1 10-2 10-3
相邻稀释度菌落数在30-300间的比值
【注意事项】
1．用平板培养计数法细菌时，待测菌稀释度的选择应根据样品而定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定标本细菌菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用10-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．用吸管稀释菌液时，放菌液过程中吸管尖不要碰到液面，以免稀释不准确，结果误差较大。
3．细菌易吸附到玻璃器皿表面，菌液加入培养皿后，应尽快倒入融化并冷至45℃～50℃的培养基，立即摇匀，以免细菌不易分散，菌落连在一起，影响计数。
【评价】
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于尿液标本中细菌含量、生物制品检验、土壤、食品含菌量测定及水源的污染程度的检测。
三、光电比浊计数法
【原理】 
当光线通过细菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，菌细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列己知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。
【试剂与器材】
1．菌种 适宜的菌培养液。
2．器材 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。
【操作步骤】
1．标准曲线制作
(1)编号：取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为l、2、3、4、5、6、7。
(2)调整菌液浓度：用血细胞计数板计数培养24h的菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106个菌数的细胞悬液。再分别装入己编好号的1至7号无菌试管中。
(3)测OD值：将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并记录OD值。
(4) 绘制标准曲线：以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇匀后，用560nm波长、1cm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
各种操作条件必须与制作标准曲线时的条件相同，否则，测得的值所换算出的含菌数不准确。
3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。 
【计算】
每毫升原液菌数=从标准曲线查得的每毫升菌数×稀释倍数
【注意事项】
1．菌悬液在测定OD值时，必须先摇匀后再倒入比色杯中测定。
2．各种操作条件必须与制作标准曲线时的条件相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。
【评价】
光电比浊计数法的优点是简便、快速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波长的选择通常在400nm～700nm之间，具体到某种细菌采用多少波长还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。
【思考题】
1．显微镜直接计数法的误差主要来自哪些方面？如何减少误差、力求准确？
2．平板培养计数法的关键是什么？
3．平板上长出的细菌不是均匀分散而是集中在一起，可能的原因是什么？
4．平板倾注法和平板涂布法长出的菌落有何不同？