二剂量法与稀释法的比较.doc

深圳技师学院应用生物系

《抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验》

论文

项 目 名 称：抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验 项 目 组 长： 唐鹏程
项 目 组 成 员： 唐鹏程 张君曼 许杰生 肖伟亨
谢秋惠 蒋铭强 李淑霞 郑慧珠
陈芃仲 李文婷 张妮 何磊
班 级： 10生物J4
指 导 教 师： 任茜 莫全毅

二0一三年三月二十一日

抗生素药物稀释法与管碟法的抗菌试验研究
唐鹏程1 谢秋惠 2 张君曼3 李淑霞4等

（全组皆为深圳技师学院，广东，深圳 518040 )
摘 要：抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下万种。抗生素已经广泛使用于我们的生活，检测药物最大抗菌效价常用方法，有药物稀释法和管碟法，为了更好的比较二种方法各自优缺点也为了方便以后实验研究提供依据。
关键词：抗生素；稀释法；管碟法；抗菌效价
试验方法
选取药物：氯霉素滴眼液 规格：8ml 20mg 国药准字H44020212
批号 130115
菌种：藤黄微球菌（Micrococcus luteus ）
培养基：营养肉汤培养基，营养琼脂培养基，抗生素效价2号培养基，0.9％生理盐水
1.预试验
1.1复苏：取藤黄微球菌（Micrococcus luteus ）冻干粉一支自然解冻，准备一瓶灭菌好的营养肉汤100ml，无菌操作，（37℃,24h）摇床培养。
1.2琼脂斜面：取复苏好的藤黄微球菌（Micrococcus luteus ）用接种环顶点沾一下在灭菌好的斜面划线（37℃,24h）培养即可。
1.3菌液制备：从上面斜面的培养物中（用接种环顶点沾一下即可）接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养18h，用直径3mm的接种环取一环菌液接种于5ml肉
汤培养基中，经37℃培养6h即可，4℃保存。
1.4找到藤黄微球菌适合的梯度：从上面斜面的培养物中（用接种环顶点沾一下即可）接种于5ml肉汤培养基中，经37℃培养18h，用直径3mm的接种环取一环菌液接种于5ml肉
汤培养基中，经37℃培养6h取出，在无菌操作下，用生理盐水稀释至，取，，做细菌总数计数。
稀释梯度至，细菌总数计数表

1
无法计数
158
44
2
无法计数
144
52
平均菌落数
无法计数
151
48
结论：由稀释梯度至，细菌总数计数表可知，为我们所需要的梯度。

一．试管法（无菌操作）
2.药物稀释法
2.1预实验（2批）：取营养肉汤100ml，试管10支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中1ml+9ml肉汤混匀，第三管取第二管1ml+9ml肉汤混匀，以此类推至第九管，取出1ml弃去，第十管不加药，只加了营养肉汤9ml。稀释完毕后，十管的药物稀释度为，，…，，及阴性。
2.2菌液制备：在上述的1.3中，菌液制备最后所得的菌液中取1ml用营养肉汤作为稀释剂梯度稀释至，用灭过菌的移液枪每管加0.05ml，第九管不加菌作为阴性对照，第十管不加药物加菌为阳性对照。加完菌后充分混匀，经37℃培养18h后判断结果。
药物稀释法找出最大抗菌效价表，加菌量为0.05ml
结果

阴性
阳性
第一批
－
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
第二批
－
－
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
抗菌效价（u）
250
25
2.5
/
/
/
/
/
/
/
备注：“－”表示澄清，“＋”表示浑浊，“/”表示没必要算
由药物稀释法找出最大抗菌效价表，可知药液的最高稀释倍数为100倍，药物抗菌效价为20x1000/8=2500u,第一管为250u，第二管为25u，第三管为2.5u。
2.3确定（最大抗菌效价，6批）：每批取营养肉汤100ml，试管7支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中2ml+18ml肉汤混匀，第三管取第二管10ml+10ml肉汤混匀，第四管取第三管10ml+10ml肉汤混匀，第五管取第四管10ml+10ml，第六管取第二管1ml+9ml，第七管不加菌作为阴性对照，第八管不加药物加菌为阳性对照。药物稀释度为1:10,1:100,1:200,1:400,1:800,1：1000，加完菌后充分混匀，经37℃培养18h后判断结果。
药物稀释法扩大梯度范围找出更加准确的抗菌效价表
结果
1：10
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1000
阴性
阳性
第一批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第二批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第三批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第三批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第四批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第五批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋
第六批
－
－
－
－
＋
＋
－
＋

试验结果：本试验所采用的藤黄微球菌在肉汤培养基中，正常情况下均为混浊生长，培养基经培养透明正常，保持原来一样状态，无细菌生长为抑菌（杀菌），以不长菌的药液最高稀释倍数为该药的抑菌效价，由药物稀释法抗菌效价表，可知1:400为最大稀释倍数，最大抗菌效价为2500/400=6.25u。

二、管碟法（2批）
3.1菌液制备：每批取营养肉汤100ml，试管6支，第一管加药物1ml+9ml肉汤充分混合，第二管取第一管中2ml+18ml肉汤混匀，第三管取第二管10ml+10ml肉汤混匀，第四管取第三管10ml+10ml肉汤混匀，第五管取第四管10ml+10ml，第六管取第二管1ml+9ml，药物稀释度为1:10,1:100,1:200,1:400,1:800,1：1000。
3.2培养基的制备：
1、先倒下层（抗生素效价2号培养基，倒入6个平皿凝固。）
2 菌液制备（营养琼脂斜面加入2ml生理盐水混匀洗脱，倒入40ml抗生 素效价2号培养基混匀，作为上层。）
3、从40ml中每皿分别取5ml迅速加入6个平皿中，混匀，凝固后作好标记。（每皿做四个 标记,1/10 两个，1/100 两个，1/200 两个，1/400 两个，1/800 两个，1/1000两个.。）
4、每皿加入4个牛津杯，滴加药液到小钢管中，分别按浓度加入1/10两个，1/100两个， 1/200两个，1/400两个，1/800两个，1/1000两个。
5、将平皿盖换成陶瓦盖。
6、恒温培养。（24h，37℃）
7、记录结果

管碟法测定最大抗菌效价表

1:10
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1000
第一批
＋
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
－
－
第二批
＋
＋
＋
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
－
－
抗菌效价（u）
2500
250
12.5
6.25
3.125
2.5
备注：“＋”表示有抑菌圈 “－”表示无抑菌圈
试验结果：本试验所采用的藤黄微球菌在抗生素效价2号培养基中，正常情况下均为混浊生长，培养基经培养正常，保持原来一样状态，在长满细菌的平皿中无出现抑菌圈 为抑菌（杀菌），以出现抑菌圈 的药液，最高稀释倍数为该药的抑菌效价，由管碟法测定最大抗菌效价表，可知1:400为最大稀释倍数，最大抗菌效价为2500/400=6.25u。

讨论：由药物稀释法与管碟法的抗菌试验两者都可以直观看到结果，药物稀释法操作简单快捷，管碟法操作复杂，技术要求较高。药物稀释法的抗菌效价计算较为简单，管碟法无法计算其抗菌效价。

参考文献：
1. 3、1.4和2.2参考了，任茜，李万波，陈国联等，《中国园艺》，2012年第四期第二十八卷，15种木兰属药用花卉抗菌试验研究
3.2参考了2010版《中华人民共和国药典》
指导老师：任茜、莫全毅

后记
通过这个项目，我们进步明显。我们学会了通过参考别人的文章，寻找适合我们的方法，制定出我们需要的方案然后实行，通过查找有关权威的资料参考，学习借用及模拟，最后能按期完成项目。在这个过程中，我们也遇到很多问题，也积极向同学及老师请教。在这个项目中，我们真诚的感谢二位导师任茜老师和莫全毅老师，感谢他们对我们第二大组的信任和付出，是他们的信任，放手让我们去思考，去阅读寻找答案，并且每天都轮流着关心与跟踪我们的实验进程及实验过程中遇到的困难。我们还要感谢余展旺老师和吴九玲老师，在我们前期实验过程中发现问题，请教他们，他们认真耐心地给我们分析及讨论，最后我们采纳了他们的观点，我们第二大组真诚的感谢所有对我们有过帮助的人，及其这四位老师，谢谢你们。