人外周血内皮组细胞的培养与鉴定.doc

人外周血内皮组细胞的培养与鉴定

付强，郑昭芬∆，彭建强，何晋，王照飞
（湖南师范大学第一附属医院 湖南省人民医院 心内科 湖南省长沙市410005）

摘要：从外周血中分离单个核细胞（MNCs），种植在纤维连接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养。培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞，镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞。培养初始2周，梭形细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网。培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后具有次级集落形成能力。流式细胞术显示内皮组细胞（EPCs）表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达。激光共聚焦显微镜下，EPCs具有摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力。
关键词：单个核细胞；内皮祖细胞；细胞形态学；细胞表型
1. 材料与方法
1.1 材料
淋巴细胞分离液购自天津灏洋，磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胎牛血清（FBS）、青链霉素购自Hyclone，EGM-2购自Lonza，胰蛋白酶购自Amresco，人纤维连接蛋白（HFN）购自merck，DiI-acLDL购自Molecular probes，FITC-UEA-I、Galetin购自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG购自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG购自Beckerman。外周学取自本课题组志愿者。
1.2 方法
1.2.1 密度梯度离心法分离人外周血MNCs及其诱导培养
1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸橼酸钠的50ml离心管，然后将抗凝血用PBS等倍稀释；将稀释后的抗凝血与人淋巴细胞分离液按1：1的比例沿离心管壁缓慢置于淋巴细胞分离液上，4℃、400g离心30 min；离心后分为4层：上层为血浆、血小板和PBS，中层为淋巴细胞分离液，底层为红细胞和粒细胞，中层与上
∆ 通讯作者。E-mail: xyxnzzf@
长沙市民生科技支撑资金专项 K1106022-31
层交界呈混浊的白膜层为MNCs层；用移液枪吸取MNCs层收集于新的50ml离心管中，用适量PBS洗涤两遍；洗涤条件为：4℃、250 g离心10min。
1.2.1.2 接种前预先将6孔板用50ug/ml Fn包被24小时（5μg/cm2 ）,接种时吸弃Fn，用PBS洗涤2次；用EGM-2诱导培养液(含 10%FBS和100U/ml青链霉素)重悬MNCs；用EGM-2诱导培养液调整其浓度至5×106个/mL，接种至6孔板中，每孔加2mL，置于37℃，5%CO2，湿度大于95%下培养；4天后首次更换培养液继续培养，以后根据营养状况每周换液2-3次，相差显微镜下观察内皮祖细胞的形态特征。
1.2.1.3 待细胞融合约80%时，弃尽旧培养液，用2mlPBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 200μL消化约1min，倒置显微镜下观察，若细胞胞质回缩、细胞间隙增宽、细胞变圆，立即用EGM-2培养液2mL终止消化，轻柔吹打混匀细胞；吸取细胞悬液置入15mL离心管中，用PBS稀释至15mL，4℃下100g离心5min，洗涤后加入EGM-2培养液重悬细胞；细胞计数后以1×104/cm2的接种密度进行传代，根据营养状况每周换液2-3次。
1.2.2 人外周血EPCs的鉴定
1.2.2.1 EPCs表型流式细胞术鉴定：第二代细胞培养至约80%融合时消化至加入1ml PBS的EP管中，250g离心5min 洗涤细胞；用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×107/ml，取1OO ul细胞混悬液置于编号（A,a-C,c）的EP管中；A-C管中分别加入下述直标抗体10 ul：鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14，同型对照a-c管中加入等量各自荧光标记的鼠IgG，室温避光孵育1h；孵育完毕后各管加入PBS 500u1，250g，离心5min，用500u1 PBS重悬、混匀后，Accuri C6流式细胞仪检测。
1.2.2.2 EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能鉴定：细胞接种前将圆形盖玻片浸于含200μl Galetin的24孔板中，孵育过夜；次日吸弃Galetin，消化第二代细胞，传代接种至24孔板中盖玻片上，根据营养状况及时更换培养基；待细胞融合约50%时吸弃培养基，PBS漂洗3次，避光加入含Di1- ac-LDL(10 ug/mL)的培养液200 ul，置于37℃, 5%C02, 95%湿度下孵育4小时；孵育完毕吸弃培养液，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min；吸弃4%多聚甲醛，PBS漂洗3次，避光加入FITC-UEA-1(10 ug/mL)200 ul,置于37℃, 5%C02, 95%湿度下1小时。滴少量Fluorescence Mounting Medium于载玻片上，用镊子小心将盖玻片夹出，PBS浸洗3次，吹干后覆盖于载玻片上，激光共聚焦显微镜观察，拍照。
2.结果
2.1 EPCs形态学特征
外周血MNCs诱导培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞（图1A），镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞（图1B）。诱导培养初始2周，梭形细胞形态逐渐变细长，数量逐渐减少，未表现出明显的增殖能力，期间可见细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网(图1C)。诱导培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后椭圆形细胞具有次级集落形成能力(图1D)；传代后细胞增殖迅速，3-4天细胞即融合成片。

图1 外周血单个核细胞向内皮祖细胞定向诱导培养的形态学特征。
2.2 EPCs的鉴定
2.2.1 EPCs表型流式细胞术鉴定
流式细胞术检测EPCs的表面标志，结果显示CD34，KDR呈阳性，而CD14无表达。

图2 流式细胞术检测EPCs细胞表型
2.2.2 EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能鉴定
激光共聚焦显微镜下，EPCs胞吞Dil-ac-LDL入胞浆，可见围绕胞核呈红色荧光的内吞泡（图3A）；胞膜结合FITC-UEA-1，呈现为绿色荧光（图3B），并胞吞入胞浆与摄取的Dil-ac-LDL共同呈现为黄色荧光（图3C）。

图3 EPCs摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的细胞荧光特征
3. 讨论
Ito等1将MNCs接种于Fn包被的培养皿中培养24小时后，将非贴壁细胞再次接种于Fn包被的培养皿，培养7天后出现类似Asaraha等2描述的“血岛样”细胞集落。该法预接种24小时是为了去除快速贴壁的单核细胞、内皮细胞等混杂细胞。Hill等3则预接种48小时后才将非贴壁细胞再次接种培养，该法诱导出的细胞称为Hill集落形成单位(Hill Colony Forming Unit，CFU-Hill)。随后Ingram等4将CFU-Hill中呈放射状的梭形细胞标记后移植入体内，未发现新生血管有标记细胞存在，研究证明这种细胞虽然表达内皮细胞标志eNOS、VEGFR2等,具有内皮细胞吞噬ac-LDL和结合UEA-1（荆豆凝集素）的性质；但这些细胞表达单核巨噬细胞系标志CD14，并具有吞噬细菌能力。Vasa等5将MNCs接种于包被Fn和明胶的培养皿，4天后去除非贴壁细胞，贴壁细胞进一步培养数天后同样表达内皮细胞标志vWF、VEGFR2,具有内皮细胞吞噬ac-LDL和结合UEA-1的能力。但该法获得的细胞也表达CD14等，并具有巨噬细胞样吞噬功能。分析认为这些单核巨噬系细胞促进血管新生的机制在于其旁分泌功能，即通过分泌促血管生成的细胞因子刺激EPCs成血管。因此也被称为循环促成血管细胞（circulating angiogenic cells，CACs）6。由此可见，不论是贴壁还是非贴壁细胞，经这些方法诱导培养后，都具有内皮细胞的一些特征，并参与血管新生，但却不直接形成新生血管。由于CFU-Hill、CAC在培养的早期阶段出现，因此称为早期新出集落（Early outgrowth colonies）或早期EPCs（Early EPCs）。我们将外周血MNCs诱导培养第4天后可见梭形或多角形贴壁细胞（图1A），镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞（图1B）。表现出早期EPCs的形态特征。诱导培养初始2周，梭形细胞形态逐渐变细长，数量逐渐减少，未表现出明显的增殖能力。
延长MNCs诱导培养时间，于培养较晚阶段出现的铺路石样细胞称为晚期新出集落（late outgrowth colonies）或晚期EPCs（late EPCs），这种细胞具有较强的增殖能力，经传代后能形成次级集落。Lin 等7将性别不匹配的骨髓移植患者的MNCs分离出来接种于1型鼠尾胶原包被的培养皿中，培养1周后所获得的细胞为受体细胞来源，这种细胞增殖能力有限。而14-21天出现的细胞克隆具有较高的增殖能力，为供体细胞来源，该研究说明具有高增殖活性的细胞来源于骨髓。Ingram等6成功地将脐带血、外周血MNCs诱导为具有高增殖活性的内皮克隆形成细胞（Endothelial Colony Forming Cells ,ECFCs)。并发现脐带血中的ECFCs增殖能力强于外周血。研究发现ECFCs仅表达内皮细胞表面标志，但是不表达CD14等巨噬细胞表面标志，也不具备细菌吞噬能力。尤为重要的是，将这些细胞标记后移植入体内，新生血管中出现标记细胞，说明ECFCs直接参与血管的形成。本研究诱导培养第3周，成功获得了铺路石样细胞；经传代后具有次级集落形成能力(图1D)；该细胞增殖迅速，3-4天细胞即融合成片，表现为晚期EPCs的形态特征。随后我们采用流式细胞术检测了细胞的表面标志，结果显示内皮细胞表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达(图2)；与上文所述的晚期EPCs特征相符。最后，本实验进一步从功能学角度鉴定了诱导培养的细胞，激光共聚焦显微镜下，细胞胞吞Dil-ac-LDL入胞浆，可见围绕胞核呈红色荧光的内吞泡（图3A）；胞膜结合FITC-UEA-1，呈现为绿色荧光（图3B），并胞吞入胞浆与摄取的Dil-ac-LDL共同呈现为黄色荧光（图3C），说明该细胞具有内皮功能。

1 Ito H, Rovira II, Bloom ML, Takeda K, Ferrans VJ, Quyyumi AA and Finkel T. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer research. 1999;59:5875-5877.
2. Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G and Isner JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275:964-966.
3. Hill JM, Zalos G, Halcox JP, Schenke WH, Waclawiw MA, Quyyumi AA and Finkel T. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 2003;348:593-600.
4. Yoder MC, Mead LE, Prater D, Krier TR, Mroueh KN, Li F, Krasich R, Temm CJ, Prchal JT and Ingram DA. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 2007;109:1801-1809.
5. Vasa M, Fichtlscherer S, Adler K, Aicher A, Martin H, Zeiher AM and Dimmeler S. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 2001;103:2885-2890.
6. Ingram DA, Mead LE, Tanaka H, Meade V, Fenoglio A, Mortell K, Pollok K, Ferkowicz MJ, Gilley D and Yoder MC. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 2004;104:2752-2760.
7. Lin Y, Weisdorf DJ, Solovey A and Hebbel RP. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of clinical Investigation. 2000;105:71-77.