Sdf1-Cxcr4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用.pdf

第5 3卷 第1 1期 2 0 2 3年1 1月中 国 海 洋 大 学 学 报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A5 3(1 1):0 7 9 0 8 6N o v.,2 0 2 3S d f 1-C x c r 4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用周董华1,2,王承昊2,范纯新1,2 (1.上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心,上海 2 0 1 3 0 6;2.上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 2 0 1 3 0 6)摘 要:为了探究S d f 1-C x c r 4信号在斑马鱼(D a n i o r e r i o)后侧线系统(P o s t e r i o r l a t e r a l l i n e s y s t e m,P L L s)发育中的作用,本研究首先通过原位杂交发现斑马鱼c x c r 4 b在迁移的侧线原基-和原基-中表达,s d f 1 a在原基迁移路径上表达。进一步构建了由热激启动子控制的c x c r 7 b过表达转基因斑马鱼,在不同时间点过表达c x c r 7 b抑制S d f 1-C x c r 4信号。结果表明:相较于野生型斑马鱼,过表达c x c r 7 b的斑马鱼的原基-和原基-的迁移明显减慢。但体侧中线神经丘的腹部迁移、间生和针脚神经丘的形成不受过表达c x c r 7 b的影响。本研究为理解鱼类侧线系统发育调控和多样性产生奠定基础。关键词:斑马鱼;侧线系统;神经丘;S d f 1-C x c r 4信号;c x c r 7 b基因中图法分类号:S 9 1 7 文献标志码:A 文章编号:1 6 7 2-5 1 7 4(2 0 2 3)1 1-0 7 9-0 8D O I:1 0.1 6 4 4 1/j.c n k i.h d x b.2 0 2 2 0 0 9 0引用格式:周董华,王承昊,范纯新.S d f 1-C x c r 4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用J.中国海洋大学学报(自然科学版),2 0 2 3,5 3(1 1):7 9-8 6.Z h o u D o n g h u a,W a n g C h e n g h a o,F a n C h u n x i n.T h e r o l e o f S d f 1-C x c r 4 s i g n a l i n g i n p o s t e r i o r l a t e r a l l i n e s y s t e m d e v e l o p-m e n t i n z e b r a f i s hJ.P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a,2 0 2 3,5 3(1 1):7 9-8 6.基金项目:国家自然科学基金面上项目(3 1 7 7 2 4 0 6)资助S u p p o r t e d b y t h e G e n e r a l P r o g r a m o f N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a(3 1 7 7 2 4 0 6)收稿日期:2 0 2 2-0 2-1 6:修订日期:2 0 2 2-0 3-2 5作者简介:周董华(1 9 9 5),男,硕士生。E-m a i l:2 9 0 3 2 4 9 9 8 0 q q.c o m 通信作者:E-m a i l:c x f a n s h o u.e d u.c n 侧线系统为鱼类和两栖类所特有,由广泛分布于体表的感觉器官神经丘构成。侧线系统对于鱼类水下生活极为重要,参与鱼类的避敌、捕食、群游和洄游等行为1。成鱼侧线感受器的分布模式具有显著的多样性,为鱼类适应不同的水流环境提供结构基础2-4。但是,目前对于鱼类侧线系统分布模式形成的机制知之甚少。斑马鱼(D a n i o r e r i o)作为模式生物,在其后侧线系统发育研究中取得了许多进展,对于理解鱼类侧线发育调控机制和模式形成起到重要作用。斑马鱼后侧线系统源自于耳后的后侧线基板(P o s t e r i o r l a t e r a l l i n e p l a c o d e)。受精后约2 0 h时,在侧线基板上特化形成初级后侧线原基(P r i m-),并延水平肌隔向尾部迁移,于受精后约4 0 h抵达尾部。原基在迁移路径上留下少量细胞形成神经丘前体(P r o t o-n e u r o m a s t),进一步分化为神经丘,排布形成体侧中线。在初级原基迁移过程中(受精后约3 6 h),后侧线基板又形成次级原基,包括P r i m-和P r i m-D。P r i m-沿水平肌隔迁移,P r i m-D向背侧迁移形成背线。从约受精后3周开始,位于体侧中线和背线上的神经丘开始向腹侧迁移,同时在原有神经丘间形成新的间生神经丘(I n t e r c a l a r y n e u r o m a s t),在仔稚鱼转换期产生躯干上的4条线。在发育至受精后2个月左右,躯干上的部分神经丘开始向周围迁移出部分细胞,由这些细胞增殖分化形成一些附属神经丘,因其排列致密成串,称为针脚神经丘(S t i t c h e s n e u r o m a s t)5。综上,斑马鱼的后侧线系统发育存在多个细胞迁移过程。S d f 1-C x c r 4信号在胚胎发育、免疫细胞动员和癌细胞转移等多种细胞迁移过程中发挥重要作用。S d f 1又称为C x c l 1 2,为趋化因子,其受体包括两类G蛋白偶联受体:C x c r 4和C x c r 7。当C x c r 4结合S d f 1时,通过G蛋白激活胞内多种信号通路引起迁移、增殖和炎症相关基因的表达6-7,当C x c r 7结合S d f 1时,不会激活典型的趋化反应,C x c r 7和S d f 1同时内化,抑制S d f 1-C x c r 4信号8。D a v i d等9和V a l e n t i n1 0发现初级侧线原基的迁移受到S d f 1-C x c r 4信号的调控。P L L s发育的第一步是P r i m-沿着水平肌间隔迁移,该过程由S d f 1/C x c r 4信号的梯度浓度驱动 1 1。S d f 1同C x c r 7的亲和力几乎是同C x c r 4的1 0倍1 2。C x c r 7可以降低S d f 1的胞外浓度,使S d f 1浓度保持在最佳水平,从而形成细胞迁移所需的趋化因子梯度1 3。斑马鱼的s d f 1 a在水平肌间隔的尾部表达,c x c r 4 b表达在迁移侧线原基的引导区,c x c r 7 b表达于迁移侧线原基的尾随区。但是,斑马鱼后侧线发育过程中其他中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年的细胞迁移事件是否也受S d f 1-C x c r 4调控尚不清楚。有研究表明,过表达c x c r 7 b可以沉默斑马鱼后侧线P r i m-中后部的s d f 1 a信号活性,而敲除或敲降s d f 1 a或c x c r 4 b会抑制侧线P r i m-的迁移 1 4。本研究中,通过构建热激启动子控制的过表达c x c r 7 b转基因斑马鱼发现,在不同时间点过表达c x c r 7 b抑制了S d f 1-C x c r 4信号,检测出过表达c x c r 7 b对P r i m-和P r i m-迁移、神经丘腹侧迁移、间生神经丘形成和针脚神经丘形成的影响,为理解鱼类侧线系统发育调控机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料实验用鱼为A B品系野生型斑马鱼和E T(g a t a 2:E G F P)1 8 9 b(简称E T 1 8 9 b)斑马鱼1 5养殖于上海海洋大学海洋生物系统和神经科学研究所。鱼房环境温度为2 6 2 8,光周期明暗=1 4 h1 0 h。按照成鱼雌、雄比例11进行交配产卵,获得的胚胎用蓝水(0.3 g/L红海盐和1 m g/L亚甲基蓝)培养于2 8.5 培养箱中。所有鱼类的实验均符合上海海洋大学动物伦理委员会的规定。质粒p T o l 2-h s p 7 0 l-T n f r s f a-P 2 A-m C h e r r y为实验室前期构建,含T o l 2转座酶的质粒p C S 2-T P a s e来自美国国立卫生研究院(N I H)S h a w n B u r g e s s实验室。引物由安升达公司合成。1.2 整体胚胎原位杂交整体原位杂交实验参考文献1 6 中的流程。野生型斑马鱼受精后3 2 h胚胎和受精后7 2 h仔鱼经 4%多聚甲醛(P F A)于4 过夜进行固定,第二天使用甲醇梯度脱水后保存于-2 0。保存过的样品首先经过含吐温2 0的磷酸缓冲液(P B S T)梯度复水,其次用 1 0%过氧化氢溶液脱色至胚胎黑色素消失,然后用不含反义探针的杂交液于7 0 孵育样品4 h,后加入含反义探针的杂交液于7 0 孵育过夜。样品依次经过漂洗、封闭、抗体孵育和漂洗等步骤,最后用N B T/B C I P s t o c k s o l u t i o n(R o c h e)在室温下显色。显色完成后,使用4%P F A 终止显色反应,再用P B S T 多次漂洗后置于 1 0 0%甘油中避光保存,最后用光学显微镜(N i-k o n)观察并拍照。表1 基因引物信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f g e n e p r i m e r s引物名称 P r i m e r n a m e引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c e(5 3)用途 A p p l i c a t i o nC x c r 7 b-V E C-FA A C C A G G G A C C A T T A G G A A G C G G A G C T A C T A A C T T C质粒构建C x c r 7 b-V E C-RC A C G T T C A C A C T C A T G G T G G C G G C A G C C T G质粒构建C x c r 7 b-O R F-FA T G A G T G T G A A C G T G A A T G A T T T C A A T G质粒构建C x c r 7 b-O R F-RT A A T G G T C C C T G G T T T T C C A C G质粒构建C x c r 4 b-FG T T T G T C C T C A C C C T G C C A T探针合成C x c r 4 b-RT A A T A C G A C T C A C T A T A G G G C C T C C T G C G G G T A A G T A A G探针合成S d f 1 a-FC A C C G A T T T C C A A C G C C A A G探针合成S d f 1 a-RT A A T A C G A C T C A C T A T A G G A C A T A T C T G T G A C G G T G G G C探针合成1.3 质粒p T o l 2-h s p 7 0 l:c x c r 7 b-P 2 A-m C h e r r y的构建以受精后4 d 的野生型斑马鱼c D N A为模板,用引物C x c r 7 b-O R F-F和C x c r 7 b-O R F-R(见表1)扩增得到c x c r 7 b的开放阅读框作为插入片段;以质粒p T o l 2-h s p 7 0 l-T n f r s f a-P 2 A-m C h e r r y为模板,用引物C x-c r 7 b-V E C-F和C x c r 7 b-V E C-R(见表1)扩增得到载体骨架,并使插入片段和载体骨架两末端具有一致的同源序列。根据C l o n E x p r e s s O n e S t e p C l o n i n g K i t(V a z y m e)说明书中的方法进行同源重组连接,将目的片段定向克隆至载体的同源位点,将新重组质粒转化E.c o l i D H 5 感受态细胞(V a z y m e),然后提取质粒,送上海生工测序得到重组质粒p T o l 2-h s p 7 0 l:c x c r 7 b-P 2 A-m C h e r r y(见图1)。图1 质粒图谱F i g.1 P l a s m i d m a p1.4 T o l 2转座酶m R N A的体外转录 用限制性内切酶X b a(T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f-i c)酶切质粒p C S 2-T P a s e。以线性化的p C S 2-T P a s e质粒D N A作为模板,采用S P 6 mM e s s a g e mM a c h i n e k i t(Am b i o n)试剂盒进行体外转录合成T o l 2 转座酶m R N A。转录出的T o l 2 转座酶m R N A由Q u i c k-R N A M i c r o P r e p K i t(Z YMO R E S E A R C H)纯化回收。081 1期周董华,等:S d f 1-C x c r 4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用1.5 建立T g(h s p 7 0 l:c x c r 7 b-P 2 A-m C h e r r y)转基因鱼显微注射前一天晚上将A B斑马鱼按照雌、雄比例1 1放入孵化盒中,用隔板将雌雄分开。第二天早晨抽去隔板,斑马鱼产卵后收集鱼卵,用于显微注射。配制质粒p T o l 2-h s p 7 0 l:c x c r 7 b-P 2 A-m C h e r r y和 T o l 2转座酶m R N A混合液(使每1 L混合液里含有2 5 n g质粒和5 0 n g T o l 2转座酶 m R N A)。将混合液注射至1-细胞期胚胎的胞质,注射剂量为1.4 n L/枚。将经过注射的F 0胚胎养至性成熟,并与A B进行杂交。选择其后代胚胎热激后具有红色荧光的F 0作为建立者(F o u n d e r),并将带有红色荧光的胚胎养至性成熟,以作为T g(h s p 7 0 l:c x c r 7 b-P 2 A-m C h e r r y)稳定遗传的转基因个体。1.6 热激过表达c x c r 7 b将c x c r 7 b 和E T 1 8 9 b转基因斑马鱼进行交配,获得的胚胎培养在蓝水中。在受精后1 8 h筛选具有绿色荧光的胚胎,并将这些胚胎分为5组,每组约5 0颗受精卵,然后按照表2中的时段进行热激(每间隔1 2 h,3 9 热激1 h,然后转至2 8.5 培养)。完成热激后,在相应的时间点在荧光倒置显微镜(Z e i s s,A x i o O b-s e r v e r)的G F P通道下,对后侧线原基所处体节的位置、神经丘数量和神经丘距离水平肌节的距离进行拍照和测量。同时,在D s R e d通道下根据红色荧光确定每条鱼是否带有c x c r 7 b转基因,带有红色荧光的作为实验组,而不带红色荧光的作为对照组。表2 实验设计T a b l e 2 D e s i g n o f t h e e x p e r i m e n t s实验目的E x p e r i m e n t a l p u r p o s e热激时段H e a t s h o c k p e r i o d观察统计时间点T i m e p o i n t o f o b s e r v a t i o nP r i m-迁移 M i g r a t i o n o f P r i m-受精后2 0 4 8 h受精后3 2和4 8 hP r i m-迁移 M i g r a t i o n o f P r i m-受精后4 5 7 2 h受精后4 8和7 2 h体侧中线神经丘腹侧迁移 V e n t r a l m i g r a t i o n o f n e u r o m a s t s i n m i d-l i n e受精后3 1 0 d受精后6和1 0 d间生神经丘形成 F o r m a t i o n o f i n t e r c a l a r y n e u r o m a s t s受精后1 5 2 1 d受精后2 1 d针脚神经丘形成 F o r m a t i o n o f s t i t c h e s n e u r o m a s t s受精后1 1.5 个月受精后1.5 个月1.7 数据统计分析每个实验的实验组和对照组样本量都大于1 0。使用蔡司公司的Z E N软件分别对迁移距离和神经丘数量进行测量和计数,将所得的数据输入至G r a p h p a d p r i s m 7软件,以对每个实验的实验组和对照组数据使用t-检验来分析数据间差异性,其中p0.0 5(用*表示)和p 0.0 0 0 1(用*表示)分别表示差异显著和差异极显著。显示迁移距离的柱状图也是由G r a p h p a d p r i s m 7 软件生成的。2 结果2.1 c x c r 4 b和s d f 1 a分别表达于迁移中的后侧线原基和水平肌间隔 受精后3 2 h是斑马鱼后侧线P r i m-和P r i m的迁移时间,受精后7 2 h是斑马鱼后侧线P r i m-D的迁移时间。本研究利用整体原位杂交技术,检测了c x c r 4 b和s d f 1 a在受精后3 2 h胚胎和在受精后7 2 h仔鱼中的表达定位。结果显示:在受精后3 2 h,c x c r 4 b在整个P r i m-中高表达,且在P r i m-引导端的表达强于后随端(见图2 A)。s d f 1 a主要表达在水平肌隔尾部,且沿着头部向尾部方向逐渐提高(见图2 C)。在受精后7 2 h,c x c r 4 b的表达则集中在P r i m-和P r i m-D(见图2 B);s d f 1 a主要表达在水平肌隔的前端和躯干的背侧(见图2 D)。由此可见,c x c r 4 b和s d f 1 a分别表达于迁移中的后侧线原基和水平肌间隔。(原位杂交结果显示在在受精后3 2和7 2 h,s d f 1 a和c x c r 4 b在斑马鱼后侧线中的表达。I n s i t u h y b r i d i z a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h e e x p r e s s i o n o f s d f1a a n d c x c r4b i n t h e z e b r a f i s h p o s t e r i o r l i n e a t 3 2 a n d 7 2 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.)图2 s d f 1 a和c x c r 4 b在斑马鱼后侧线中的表达F i g.2 E x p r e s s i o n o f s d f 1 a a n d c x c r 4 b i n t h e p o s t e r i o r l a t e r a l l i n e o f z e b r a f i s h18中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年2.2 过表达c x c r 7 b对P r i m-迁移的影响为了检测S d f 1-C x c r 4信号在后侧线P r i m-迁移中的作用,本文作者构建了c x c r 7 b转基因鱼,通过热激过表达c x c r 7 b,进而抑制S d f 1-C x c r 4信号。结果表明:热激后的c x c r 7 b转基因胚胎同野生型在外观形态上没有明显的差异。在E T 1 8 9 b背景下,本文作者观察到野生型的P r i m-在3 2 h迁移至躯干第(9.7 5 0 00.2 1 7 6)个体节,在受精后4 8 h迁移至尾部末端。但在c x c r 7 b转基因个体中P r i m-在受精后3 2 h仅迁移至第(4.0 8 3 0 0.1 9 3 0)个体节,差异显著(p 0.0 0 0 1)(见图3 A、C);在受精后4 8 h仅迁移至第(1 0.0 0 0 00.4 9 2 4)个体节,差异显著(p 0.0 0 0 1)(见图3 B、D)。基于P r i m-所处体节位置,定量分析显示c x c r 7 b转基因个体P r i m-的迁移显著慢于野生型P r i m-的迁移。(A:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后3 2 h P r i m-所处位置。B:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后4 8 h P r i m-所处位置。比例尺=1 0 0 m。C:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后3 2 h P r i m-所处体节数定量分析。D:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后4 8 h P r i m-所处体节数定量分析。:p 0.0 0 0 1。WT:野生斑马鱼。T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b转基因斑马鱼。A:T h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t t h e 3 2 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.B:T h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b z e b r a f i s h a t 4 8 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.S c a l e b a r=1 0 0 m.C:T h e q u a n t i f i c a t i o n a n a l y s i s o f t h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t 3 2 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.D:T h e q u a n t i f i-c a t i o n a n a l y s i s o f t h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t 4 8 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.:P 0.0 0 0 1.WT:W i l d-t y p e z e-b r a f i s h.T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h.)图3 过表达c x c r 7 b抑制P r i m-迁移F i g.3 O v e r e x p r e s s i o n o f c x c r 7 b i n h i b i t s t h e m i g r a t i o n o f P r i m-2.3 过表达c x c r 7 b对P r i m-迁移的影响在P r i m-迁移至尾部后,耳后的侧线基板处形成新的原基(P r i m-和P r i m-D),它们分别向尾部和背部迁移。为了探究S d f 1-C x c r 4信号在P r i m-和P r i m-D迁移过程中的作用,本文作者从受精后4 5 h开始热激,然后在受精后4 8和7 2 h对野生型和c x c r 7 b转基因个体的P r i m-和P r i m-D的迁移位置进行观察。对于野生型而言,在受精后4 8 h,P r i m-和P r i m-D刚刚开始从后侧线基板处迁出,迁移至第(1.4 1 7 0 0.1 4 8 6)体节;在受精后7 2 h,P r i m-大致到达第(9.7 8 6 00.2 3 8 6)体节,P r i m-D已接近背中线。在受精后4 8 h,c x c r 7 b转基因个体的P r i m-和P r i m-D迁移至第1体节,差异显著(p=0.0 1 0 4)(见图3 A、C);在受精后7 2 h,c x c r 7 b转基因个体的P r i m-大约迁移至第(8.0 0 0 00.2 0 9 7)体节,差异显著(p 0.0 0 0 1)(见图3 B、D)。P r i m-D距离背侧中线还存在一定的距离,它们的迁移速度均显著慢于对照组。2.4 过表达c x c r 7 b对体侧中线神经丘腹侧迁移和神经丘生成数量的影响 从受精后3 d开始,斑马鱼躯干中线的神经丘开始向腹侧迁移。本文作者在斑马鱼受精后3 d对c x c r 7 b转基因和野生型进行热激,受精后6和1 0 d分别测量体侧中线神经丘与水平肌隔的距离。结果显示:在受精后6 d,野生型组与过表达c x c r 7 b组两组体侧中线神经丘的腹侧迁移距离分别为(7 6.9 8 0 0 1.7 6 0 0)和(7 6.4 1 0 0 1.7 8 3 0)m,两者差异不显著(p=0.8 2 2 3)(见图5 A、C);在受精后1 0 d,野生型组与过表达c x-c r 7 b组 体 侧 中 线 神 经 丘 的 腹 侧 迁 移 距 离 分 别 为(7 4.5 2 0 0 1.9 5 8 0)和(7 1.9 7 0 03.0 4 4 0)m,两者差异不显著(p=0.5 3 2 9)(见图5 B、E)。另外,本文作者通过计数后侧线单侧的神经丘总数反映后侧线神经丘的数量。结果显示:在受精后6 d,野生型组与过表达c x c r7b组单侧侧线神经丘总数分别为(1 5.2 0 0 00.2 7 9 5)和(1 5.8 7 0 00.2 3 6 4)281 1期周董华,等:S d f 1-C x c r 4信号在斑马鱼后侧线系统发育中的作用个,两者差异不显著(p=0.0 7 9 2)(见图5 A、D);在受精后1 0 d,野生型组与过表达c x c r 7 b组单侧侧线神经丘总数分别为(1 6.3 1 0 00.2 6 2 7)个和(1 6.6 3 0 0 0.2 2 1 3)个,两者差异不显著(p=0.3 6 0 4)(见图5 B、F)。综上表明:过表达c x c r 7 b对体侧中线神经丘腹侧迁移和神经丘生成总数均没有明显的影响。(A:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后4 8 h P r i m-和P r i m-D所处位置。B:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后7 2 h P r i m-和P r i m-D所处位置。比例尺=1 0 0 m。C:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后4 8 h P r i m-所处体节数定量分析。D:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后7 2 h P r i m-所处体节数定量分析。:P 0.0 5;:P 0.0 0 0 1。WT:野生斑马鱼。T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b转基因斑马鱼。A:T h e p o s i t i o n o f P r i m-a n d P r i m D i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t t h e 4 8 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.B:T h e p o s i t i o n o f P r i m-a n d P r i m D i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t t h e 7 2 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.S c a l e b a r=1 0 0 m.C:T h e q u a n t i f i c a t i o n a n a l y s i s o f t h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t i a n s g e n i c z e b r a f i s h a t 4 8 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.D:T h e q u a n t i f i c a t i o n a n a l y s i s o f t h e p o s i t i o n o f P r i m-i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e-b r a f i s h a t 7 2 h p o s t-f e r t i l i z a t i o n.:P 0.0 5;:P 0.0 0 0 1.WT:W i l d-t y p e z e b r a f i s h.T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h.)图4 过表达c x c r 7 b抑制P r i m-迁移F i g.4 O v e r e x p r e s s i o n o f c x c r 7 b i n h i b i t s P r i m-m i g r a t i o n(A:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后6 d侧线神经丘所处位置。B:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后1 0 d侧线神经丘所处位置。比例尺=5 0 0 m。C、E:表示野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后6和1 0 d体侧中线神经丘与水平肌隔的距离比较。D、F:分别表示野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后6和1 0 d的侧线神经丘总数比较。n s:无显著性差异。WT:野生斑马鱼。T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b转基因斑马鱼。A:T h e p o s i t i o n o f l a t-e r a l l i n e n e u r o m a s t i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t t h e 6 d p o s t-f e r t i l i z a t i o n.B:T h e p o s i t i o n o f l a t e r a l l i n e n e u r o m a s t i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t t h e 1 0 d p o s t-f e r t i l i z a t i o n.S c a l e b a r=5 0 0 m.C,E:T h e c o m p a r i s o n o f t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e l a t e r a l m i d l i n e n e u r o-m a s t a n d t h e h o r i z o n t a l m y o s e p t u m i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t 6 a n d 1 0 d p o s t-f e r t i l i z a t i o n.D,F:T h e c o m p a r i s o n o f t h e t o t a l n u m-b e r o f l a t e r a l l i n e n e u r o m a s t s i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h a t 6 a n d 1 0 d p o s t-f e r t i l i z a t i o n.n s:N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e.WT:W i l d-t y p e z e b r a f i s h.T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b t r a n s g e n i c z e b r a f i s h.)图5 过表达c x c r 7 b对体侧中线神经丘腹侧迁移和神经丘生成数量没有影响F i g.5 O v e r e x p r e s s i o n o f c x c r 7 b h a s n o e f f e c t o n t h e v e n t r a l m i g r a t i o n o f t h e l a t e r a l m i d l i n e n e u r o m a s t a n d t h e n u m b e r o f n e u r o m a s t s g e n e r a t e d38中 国 海 洋 大 学 学 报2 0 2 3 年2.5 过表达c x c r 7 b对体侧中线间生神经丘生成的影响从受精后约1 5 d开始,原始神经丘间的丘间细胞增殖分化形成间生神经丘,间插在原始神经丘之间。在受精后1 5 d时对c x c r 7 b转基因和野生型进行热激,在受精后2 1 d时计数体侧中线神经丘的总数。结果显示:野生型组与过表达c x c r 7 b组的体侧中线神经丘总数分别为(1 8.1 0 0 0 1.1 0 0 0)个和(1 6.3 0 0 0 1.0 1 2 0)个,差异不显著(p=0.2 4 4 0)(见图6 A、B)。体侧中线神经丘包含原始神经丘和间生神经丘。由于原始神经丘不受过表达c x c r 7 b的影响,本文作者推测间生神经丘也不受过表达c x c r 7 b的影响。(A:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在2 1 d p o s t-f e r t i l i z a t i o n侧线神经丘所处位置。比例尺=5 0 0 m。B:野生型和c x c r 7 b转基因斑马鱼在受精后2 1 d体侧中线神经丘总数比较。n s:无显著性差异。WT:野生斑马鱼。T r a n-c x c r 7 b:c x c r 7 b转基因斑马鱼。A:T h e p o s i t i o n o f l a t e r a l l i n e n e u r o m a s t i n w i l d-t y p e a n d c x c r 7 b t