不同绵羊品种发情期卵巢组织lncRNA和mRNA的差异表达分析.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:杨帆硕士研究生通信作者:王锋教授研究方向为肉羊繁殖调控:.杨帆姚晓磊李康等.不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析.南京农业大学学报():.():.不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析杨帆姚晓磊李康李晓丹唐轮尤佩华蔡庆贤王锋(.南京农业大学动物科技学院江苏 南京.广西大化瑶族自治县畜牧管理站广西 大化.江苏波杜农牧股份有限公司江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在探究不同绵羊品种发情期卵巢组织中长链非编码()和信使()的差异表达筛选绵羊繁殖力相关的分子标记 方方法法 根据羊场生产记录挑选 岁体型、生理状态相似的空怀蒙古羊()和湖羊()各 只对其进行同期发情处理发情时密集采血 (每次隔 )检测血清中促卵泡刺激素()和促黄体生成素()含量各组随机挑选 只屠宰采集卵巢组织用于转录组测序()从 数据库中下载小尾寒羊()和陶赛特羊()发情期卵巢 数据整合分析不同绵羊品种卵巢中 和 的表达特征 结结果果 湖羊血清中 和 含量均显著高于蒙古羊(.)共鉴定到 个 转录本在 个差异分组均获得一定数量的差异 和 并从中筛选与繁殖相关的共有和特有 和 去除新基因后分别构建 和 互作网络筛选到、和 等与繁殖相关的共有差异基因与繁殖相关的共有差异 主要注释到受精、卵母细胞成熟和配子发生等条目富集于 和 等信号通路关键基因()在蒙古羊和湖羊全身组织中表达趋势一致均在卵巢组织中高表达且在湖羊垂体、卵巢和子宫组织中均检测到 蛋白阳性信号 结结论论 本研究绘制了湖羊和蒙古羊卵巢组织中差异 和 表达图谱筛选到与繁殖相关的 和 为绵羊繁殖调控及育种分子标记奠定基础 关键基因 可能通过生殖轴调控绵羊的繁殖性能关键词:绵羊发情期繁殖性状卵巢中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):()().()().(/)()().().(.).第 期杨帆等:不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析 .:绵羊作为我国重要的经济动物能够提供肉、奶、纤维等优质的农畜产品 虽然我国绵羊品种资源丰富但绝大部分表现为产羔率低、季节性发情规模化舍饲的快速发展对种羊繁殖性能提出了更高的要求 因此选育优良品种提高绵羊繁殖力一直是绵羊育种的关键 湖羊和小尾寒羊是我国优良的多胎绵羊品种湖羊更是以性早熟、全年发情以及高繁殖力而闻名 蒙古羊和陶赛特羊作为地方性品种具有适应性强、产肉性能高等特点但其繁殖力较低 因此开展绵羊不同品种间繁殖力差异的研究显得尤为重要绵羊的多胎性或高繁殖力现象早就引起科学界的高度重视并已经成功鉴定出多个绵羊繁殖力相关基因(骨形态发生蛋白受体)、(生长分化因子)、(骨形态发生蛋白)和(乙酰氨基半乳糖转移酶)等但数量还较为有限 湖羊和小尾寒羊是我国少有携带多胎主效基因()的绵羊品种 但在实际生产中携带纯合 基因的湖羊也存在产单羔现象这种差异表明 与多胎性之间可能存在其他调控机制长链非编码()作为一种新的表观遗传调控分子在家畜繁殖中直接或间接参与基因调控过程 为揭示 对哺乳动物繁殖力的调控机制研究者围绕不同繁殖力母羊的下丘脑垂体卵巢子宫轴开展了相关研究 郑健等对单多羔湖羊下丘脑进行转录组分析发现下丘脑中神经信号传递通路和 氨基丁酸信号通路可能间接调控卵泡发育及排卵过程 从高、低繁绵羊垂体的 调控网络中筛选到(家庭成员)、(神经介素)和(肝配蛋白)等与繁殖相关的基因 此外在不同繁殖力湖羊卵巢的研究中卵泡发育相关 可吸附颗粒细胞中的 并阻止 与核心蛋白聚糖()基因的区域结合导致湖羊 基因转录激活和 通路抑制 同时研究者以发情期不同繁殖力的寒泊羊、小尾寒羊与陶赛特、安徽白山羊卵巢为对象通过转录组测序()后均获得一定数量与繁殖相关的差异 也有研究者发现 还参与绵羊卵巢、睾丸发育及初情期启动等过程 以上研究表明 在调控肉羊繁殖性能中发挥着关键作用 然而上述研究大多数侧重于筛选同一品种不同繁殖力绵羊之间的差异 而关于不同绵羊品种之间的研究相对较少本研究选取地方特色绵羊品种湖羊()和蒙古羊()为研究对象在发情期采集卵巢组织进行再结合 数据库中已有的小尾寒羊()和陶赛特羊()发情期卵巢数据比较分析不同绵羊品种发情期卵巢中差异表达的 和 构建 和 调控网络筛选关键基因并探究其表达规律为绵羊繁殖调控及育种分子标记提供理论依据 材料与方法.试验动物本试验于江苏省泰州市姜堰某羊场进行根据生产记录选择 岁体况相近、生殖生理状态相似的空怀湖羊(.)只 同时选择相同条件的空怀蒙古羊(.)只 试验羊只每天:、:饲喂全混合()日粮自由饮水.试验材料绵羊促卵泡激素()和促黄体生成素()试剂盒()均购自上海卡迈舒生物科技有限公司 试剂盒购自 反转录试剂盒()和荧光定量试剂盒南 京 农 业 大 学 学 报第 卷()均购自南京诺唯赞生物科技有限公司即用型免疫组化试剂盒()购自上海爱必信生物科技有限公司基质金属蛋白酶()抗体()购自沈阳万类生物有限公司.试验设计蒙古羊和湖羊各 只于 月份采用单栏方式饲养于第 天:放拴处理 后撤拴并注射氯前列烯醇每只.次日用公羊试情接受公羊爬跨视为发情 到下一次自然发情时颈静脉密集连续采血每 次连续采集 分离血清后置于 保存备用 采血后随机挑选蒙古羊和湖羊各 只进行屠宰分别采集下丘脑、垂体、卵巢、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织样单侧发育较好的卵巢放入液氮用于后续 另一侧卵巢以及垂体和子宫组织用布氏固定液固定用于后续免疫组化检测 其余组织样经液氮速冻后于 冰箱保存.试验方法.生殖激素的测定 对上述置于 的血清进行 和 含量测定试验步骤严格按照 和 检测试剂盒说明书进行.总 提取及建库 利用 法对蒙古羊和湖羊全身组织提取总 卵巢 的质量测定、文库构建和测序交由北京百迈客生物科技有限公司采用 系统进行 同时小尾寒羊(、)和陶赛特羊(、)的测序原始数据下载于(:/./)的 数据库.转录组数据分析 对测序的原始数据()进行过滤使用 软件将质控后序列()与绵羊基因组(.)进行序列比对获得 在绵羊基因组上的位置信息()以及湖羊卵巢组织特有序列信息使用 软件对转录本和基因表达量进行分析同时利用 软件将 进行转录本拼接以此对 进行鉴定 鉴定 包括筛选和潜在编码能力分析选择长度 数 ().的转录本和利用、和 等 种编码潜能的分析方法评估使用顺式作用(邻近 )和反式作用(软件)种方法预测 靶基因使用 方法对基因和转录本的表达量进行差异分析获得差异 和 差异分组:、前者为对照组限定条件:差异倍数()错误发现率().使用 语言包中 对差异 的靶基因和 在 功能数据库中进行富集分析使用 软件进行 通路显著富集分析使用 数据库(:/./)预测并绘制 的蛋白互作()网络利用 软件绘制 互作图.实时荧光定量()为验证测序结果的准确性从测序结果中随机挑选 个 和 进行验证 根据 公布的绵羊基因序列以及测序拼接后获得的 序列采用.软件设计引物以 为内参基因引物由南京擎科生物有限公司合成(表)按照诺唯赞公司试剂盒操作说明进行反应体系为 采用 法计算基因的相对表达量表 引物序列信息 基因引物对序列 ()产物长度/登录号././././././././././.注:):分泌型卷曲相关蛋白 :低密度脂受体蛋白 :卷曲同源物 :基质金属蛋白酶 :生长分化因子 :甘油 醛 磷 酸 脱 氢 酶 基 因 .).、.、.、.和.为 绵 羊 .第 期杨帆等:不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析.免疫组化检测 湖羊垂体、卵巢和子宫组织采用布氏固定液固定 后进行石蜡包埋和组织切片切片厚度 烤片 免疫组化检测步骤参考本实验室的前期研究 一抗为 兔多克隆抗体以 进行稀释二抗 酶标抗小鼠和兔二聚物为试剂盒即用试剂对照组用兔血清代替一抗其余步骤保持一致.数据分析所有数据使用 软件初步处理后使用 软件进行差异显著性检验和单因素方差分析并绘图 数据结果以平均值标准误表示 结果与分析.发情期湖羊和蒙古羊生殖激素水平比较对发情期湖羊和蒙古羊血清中 和 激素含量进行检测结果如图 所示湖羊血清中 和 含量均显著高于蒙古羊(.)图 湖羊和蒙古羊血清中促卵泡激素()和促黄体生成素()含量差异 ()().不同绵羊品种卵巢中 与 的比较分析 后对 进行过滤共得到.如表 所示数据与绵羊(.)参考基因组比对匹配效率.值均在.以上总碱基中 含量为.表明测序结果良好 质量合格可进行下一步数据分析 本研究共鉴定到 个(图)其中基因间区 个占比.反义 个占比.内含子 个占比.正义 个占比.(图)在不同染色体中均有不同程度的分布其中在 号常染色体上最多(图)这与在绵羊下丘脑上的研究结果一致 表达量整体低于(图)的 长度在 所占比例最高而 的 长度主要分布在 (图)和 的序列长度主要分布在 (图)主要包含 个外显子其数量明显少于(图)表 样品测序数据统计表 品种样品 质控后序列 序列数(匹配率)()含量/值/陶赛特羊()小尾寒羊()湖羊()蒙古羊()(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).注:小尾寒羊(、)和陶赛特羊(、)的原始数据下载于 数据 库 ()().南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 不同绵羊品种卵巢组织中长链非编码()和信使()的鉴定 ()().数统计的韦恩图.的分类及数量.的染色体分布最外面的环代表染色体中间从外向内分别是正义(绿色)、基因间(红色)、内含子(蓝色)和反义(灰色).和 相对表达量.和 长度.和 长度.和 外显子数量.:()()()().不同差异分组间 和 差异表达分析如图 所示经过差异比对在 、个差异分组中分别获得(上调)(下调)、()、()、()、()个差异 ()、()、()、()、()个差异 为验证 结果的准确性分别随机选取 个 和 进行 验证 结果表明.、.和.的 相对表达量在蒙古羊卵巢组织中显著高于湖羊(图.)这与测序中 值的趋势一致(图)而、(分泌型卷曲相关蛋白)、(低密度脂受体蛋白)和(卷曲同源物)在内的 个 表达差异也与测序相同(图 和)证明测序结果可靠可用于后续功能分析 第 期杨帆等:不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析图 不同差异分组间()和()的差异数量 ()()图 湖羊和蒙古羊卵巢中 和 的验证 .的相对表达量 .的 值 ().的相对表达量 .的 值 .不同差异分组中共有和特有差异基因分析及蛋白互作网络构建如图 所示:在 个差异分组 、中存在 个共有差异表达基因()去除新基因后经 网站预测其中 个 存在互作关系构建蛋白质互作()网络图(图)功能富集分析进一步筛选到、(软骨黏附素)、(子宫内膜同源盒基因)、(蛋白)、(型胶原)、(肌动蛋白)、(型胶原蛋白)、(反应元件结合蛋白 样)和 等 个与繁殖相关的共有 同时 个组分别获得、个与繁殖相关的特有(图)组中鉴定到、(卵泡抑素样蛋白)等多个与繁殖相关的基因.不同差异分组中共有和特有差异 分析及 网络构建进一步对各组共有和特有 进行筛选共鉴定到 个共有差异(图)对其进行功能注释从中选择与繁殖相关的差异 主要富集到受精、卵母细胞成熟、配子发生等条目(图)在 富集分析中主要富集到嗅觉传导、核糖体、转运等通路 繁殖相关差异 则富集到、等信号通路(图)其中.、.和.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 共有差异基因()的蛋白互作网络图 ().各差异分组的 数 .蛋白互作网络 .图 与繁殖相关 的互作网络 .各差异分组中差异 的数量 .互作网络 .第 期杨帆等:不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析均靶向 基因 进一步提高筛选条件后(.)获得 个与雌性生殖相关的差异 构建其 的互作网络(图)其中存在多个靶向 信号通路关键基因的如图 所示:在 个差异分组中分别存在 、个特有差异 经功能富集分析获得 、个特有差异 与繁殖相关 在 个差异分组中均存在靶向共有差异基因 的特有差异 图 与繁殖相关差异 靶基因的 和 分析 .繁殖相关差异 的 分析 .繁殖相关差异 的 分析 .基质金属蛋白酶()在湖羊和蒙古羊全身组织中的表达模式如上所述 基因在各差异分组中均差异显著因此以 为对象检测其在蒙古羊和湖羊组织中的表达模式 结果(图)表明 基因在湖羊和蒙古羊中表达趋势一致均在卵巢组织中高表达其次则是在肺脏中有较高表达 蛋白在湖羊腺垂体细胞(垂体)、颗粒细胞(卵巢)、子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞(子宫)中均检测到阳性信号(图)讨论多胎性是绵羊种畜最重要的评价指标其不仅与遗传因素(品种)有关还受到表观遗传调控的影响研究表明 参与卵巢发育、卵子发生、妊娠维持等生殖过程这为探究 调控绵羊繁殖性能提供契机 因此本研究对不同绵羊品种发情期卵巢组织进行 分析后发现在 个差异分组(、)中分别获得 、南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 基质金属蛋白酶()在湖羊和蒙古羊组织中的表达模式 ().在蒙古羊和湖羊组织中的表达量.在湖羊垂体、卵巢和子宫中的表达定位(:阴性对照:腺垂体细胞:颗粒细胞:腔上皮细胞:腺上皮细胞).(:).、个差异 和 、和 个差异 有学者结合湖羊的体型以及蒙古羊的南迁历史认为蒙古羊是湖羊的祖先 而在 组中差异 和 数最少在一定程度上也证实了这个说法 因此 个亲缘关系较近的绵羊品种造成繁殖力差异的 和 更值得我们关注经 验证后进一步对共有差异 和 进行功能注释发现与繁殖相关的共有差异 主要注释到受精、卵母细胞成熟、配子发生等条目富集到、等已被证实与繁殖相关的通路中并构建了 互作网路图这为后续深入探究绵羊繁殖力调控机制提供参考 其中.、.等多个差异 均靶向 通路相关基因这与前人的研究结果一致提示 可能通过调控 通路关键基因来影响绵羊繁殖力 同时本研究筛选获得 个(、等)与繁殖相关的共有 基因被认为是子宫内膜容受性的关键调控因子 蛋白也在小鼠胚胎和卵巢中较高表达 在不同绵羊品种卵巢组织中均存在显著差异表明这些 可能在绵羊卵巢的分子调控机制中发挥重要作用 此外在 组中筛选到、等与繁殖相关的特有 已被证实与绵羊繁殖力相关 基因可以通过降低绵羊孕激素水平调节绵羊的发情周期 以上研究表明 和 可能参与绵羊繁殖力的调控过程但具体机制有待揭示 第 期杨帆等:不同绵羊品种发情期卵巢组织 和 的差异表达分析如上所述在各差异分组中 信号通路关键基因 及相关 的表达水平存在显著差异 蛋白能够降解型胶原蛋白促使卵泡形态发生改变对哺乳动物卵泡发育发挥重要作用本研究结果表明 蛋白在湖羊垂体、卵巢和子宫组织中均检测到阳性信号在蒙古羊和湖羊的卵巢组织中呈现高表达状态提示 基因可能参与绵羊繁殖调控过程 有学者认为 的高表达可能是卵泡闭锁的标志参与优势卵泡的选择这在一定程度上解释了本试验中低繁蒙古羊卵巢中 表达量高于高繁湖羊的原因但具体机制仍需进一步验证另外 和 是主导卵泡发育的 种主要激素 初情期后 和 对卵泡发育起主要调节作用且二者相互协调刺激卵泡成熟与排卵 由于多胎性与卵泡发育关系密切且与排卵优势卵泡数量直接相关因此 与 含量与绵羊的产羔性状存在一定的相关性 本课题组前期研究发现高繁湖羊中 水平显著高于低繁湖羊 与此类似不同绵羊品种中发情期单羔美利奴羊中 和 含量均显著低于多羔湖羊这在一定程度上验证了本研究中湖羊血清中 和 含量显著高于蒙古羊的结论 但也有研究者认为这是高繁绵羊卵巢卵泡对 和 的灵敏度更高造成的结果综上本试验绘制了不同绵羊品种卵巢组织中差异 和 表达图谱筛选到与繁殖相关的 和 探究候选基因 在不同组织中的表达差异并初步确定 蛋白的表达定位为后续揭示 参与绵羊繁殖力的调控机制奠定基础参考文献:.:.():.惠富平邵文挥孙雁冰.湖羊繁育史及其当代保种考述.畜牧与兽医():.():().():.().:.():.():.():.():.:.():.():.:.()():.郑健李奉哲冯旭等.单多羔湖羊下丘脑转录组比较分析.中国兽医学报():.():().():./.:.():.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 .:.:.().():.():.().():.安世钰张国敏尤佩华等./通路核心基因在湖羊睾丸发育过程中的表达变化.南京农业大学学报():.:././.():().:./.():.():.():.李群.湖羊的来源及历史再探.中国农史():.():().():.:.:.:.().():.孔亚茹周小枫熊浩铭等.基质金属蛋白酶 和 在哺乳动物卵泡发育中的作用研究进展.广东农业科学():.():().():.():.郑亦辉张德福马恒东.湖羊和美利奴羊发情期外周血浆中促性腺激素脉冲分泌的差异.中国畜牧杂志():.():().():.责任编辑:周广礼