UPLC-MS_MS法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:徐一丹硕士研究生通信作者:余祖功教授主要从事新兽药药理研究及兽药新制剂的研发:.徐一丹郭凡溪刘利锋等./法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究.南京农业大学学报():./.():./法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究徐一丹郭凡溪刘利锋张冯奕驰王俊丽邹远鹏余元倩余祖功(.南京农业大学动物医学院江苏 南京.南京朗博特动物药业有限公司江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在建立检测犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片的/方法并进行犬口服国产阿莫西林克拉维酸钾片与参比制剂的生物等效性评价 方方法法 以乙腈和甲酸水溶液为流动相经 色谱柱梯度洗脱阿莫西林和克拉维酸分别用电喷雾正、负离子模式进行多反应监测()血浆样品用乙腈沉淀蛋白、二氯甲烷萃取对于克拉维酸血浆样品的预处理增加正己烷除脂的步骤经方法学验证后分别检测血浆样品中阿莫西林与克拉维酸浓度 生物等效性试验采用单剂量、双处理、双周期随机交叉试验设计选用 只健康成年比格犬按顺序分别空腹口服参比制剂或受试制剂 再用建立的/法检测血浆中阿莫西林和克拉维酸的浓度采用 .药动学软件的非房室模型计算药物的药动学参数对、和 进行对数转换后分析药物生物等效性 结结果果 该方法专属性良好阿莫西林在 、克拉维酸在 浓度范围内的信号响应值与浓度线性关系良好(.)批内、批间准确度偏差均在以内批内、批间精密度均在 以内基质效应符合要求阿莫西林和克拉维酸在试验条件下稳定 参比制剂和受试制剂中:阿莫西林的 分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)克拉维酸的 分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)、经对数转换后几何均值比的 置信区间均落在.经非参数检验无明显差异 结结论论 所建/方法符合生物样品分析要求国产阿莫西林克拉维酸钾片与参比制剂在犬体内生物等效关键词:阿莫西林克拉维酸/犬生物等效性中图分类号:.文献标志码:文章编号:()/(.):/.().第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究 ./.(.).(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)./.:/阿莫西林属半合成广谱青霉素类抗生素化学名称为()二甲基()()氨基(羟基苯基)乙酰氨基氧代硫杂氮杂双环.庚烷甲酸三水合物通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥杀菌作用 它对金葡菌、链球菌、棒状杆菌等革兰阳性菌以及大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等革兰阴性菌均有较强作用 阿莫西林耐胃酸但不耐 内酰胺酶易被 内酰胺酶水解破坏 克拉维酸是一种 内酰胺酶抑制剂化学名称为()(羟基亚乙基)氧代氧杂氮杂双环.庚烷羧酸仅有微弱的抗菌活性不单独用于抗菌治疗通常与阿莫西林等内酰胺抗生素合用以克服细菌的耐药性 阿莫西林克拉维酸钾片在宠物临床应用于敏感菌所致的各种感染如皮肤及软组织感染、尿道感染、呼吸道感染等 农业农村部已将宠物用阿莫西林克拉维酸钾片列入兽药比对试验目录(第一批)近年来宠物医疗行业在我国发展迅猛国内宠物用阿莫西林克拉维酸钾制剂生产企业稀少应用前景广阔 本研究首先建立犬血浆中阿莫西林和克拉维酸浓度的/检测方法并应用该方法开展国产阿莫西林克拉维酸钾片与进口产品(参比制剂)在犬体内的生物等效性试验为国内宠物制药企业生产的阿莫西林克拉维酸钾片的申请上市提供技术支持 材料与方法.药品与试剂阿莫西林对照品中国食品药品鉴定研究所批号 纯度.克拉维酸标准品中国食品药品鉴定研究所批号 纯度.阿莫西林 标准品(阿莫西林的内标):批号化学纯度.同位素纯度.阿莫西林克拉维酸片参比制剂意大利豪普特制药厂批号 规格为 阿莫西林克拉维酸片受试制剂南京朗博特动物药业有限公司批号 规格为 超纯水由 公司生产的 型水纯化系统制备甲醇和乙腈德国 公司色谱级甲酸美国 公司质谱级二氯甲烷、正己烷、乙酸铵、冰醋酸均为分析纯级试剂.仪器设备 系统超高效液相色谱仪(美国 公司)型三重四极杆串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国 公司)型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)型和 型低温高速离心机(德国 公司)型水纯化系统(美国 公司)型涡旋混合仪(上海驰唐电子有限公司)型超声波清洗仪(美国南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 公司)型振荡器(公司)型冰箱(海尔集团)型超低温冰箱(赛默飞世尔仪器有限公司).实验动物 只成年健康比格犬雌雄各半体重为(.)来源于江苏亚东实验动物研究中心 将实验犬饲养于南京农业大学实验动物中心普通动物房内饲喂不含任何抗菌药物的实验犬维持饲料试验前进行 的适应性饲养和观察.相关溶液的制备.对照品储备液 阿莫西林储备液:精确称量阿莫西林对照品置于 量瓶用 甲醇水溶解并稀释至刻度摇匀制成 的储备液 克拉维酸储备液:精确称量克拉维酸对照品置于 量瓶用 乙腈水超声溶解并稀释至刻度摇匀制成 的储备液 对照品储备液平行制备 份分别用于标准曲线和质控样品的制备 阿莫西林 储备液:精确量取 甲醇水 溶解阿莫西林()后将全部溶液转移至 容量瓶中用 甲醇水稀释至刻度摇匀即得内标储备液 储备液均置于 冷冻保存.系列工作液 用超纯水精确稀释阿莫西林储备液制成.、的阿莫西林系列标准曲线工作液和.、.、的阿莫西林质控工作液用超纯水精确稀释克拉维酸储备液制成、的克拉维酸系列标准曲线工作液和、的克拉维酸质控工作液 精确量取内标储备液适量用超纯水稀释 倍即得 内标工作液 工作液于 保存备用./测定方法.色谱条件 色谱柱为 (.)流速.进样量 柱温 阿莫西林:进样室温度 流动相 为乙腈流动相 为体积分数.的甲酸水溶液 洗脱程序:.克拉维酸:进样室温度 流动相 为乙腈流动相 为体积分数.的甲酸水溶液 梯度洗脱程序:.质谱条件 采用电喷雾离子源使分析物离子化并在多反应监测()模式下分别对阿莫西林及内标进行正离子()监测对克拉维酸及内标进行负离子()监测 阿莫西林:毛细管电压.离子源温度 脱溶剂温度 脱溶剂气流速 锥孔气流速 克拉维酸:毛细管电压.离子源温度 脱溶剂温度 脱溶剂气流速 锥孔气流速 各化合物的定量定性离子对、锥孔电压和碰撞能见表 表 阿莫西林、克拉维酸和内标的质谱参数 监测模式 分析物离子对/锥孔电压/碰撞能量/阿莫西林.阿莫西林.克拉维酸 注:此离子对用于定量分析 .血浆样品预处理.阿莫西林血样预处理)取血浆样品 精确加入内标工作液 涡旋 加入醋酸铵缓冲液(.)和乙腈 涡旋 振荡 、离心 )取上清液.加入二氯甲烷 涡旋 、离心)取上层水相 加超纯水 涡旋混匀.滤头过滤后进样分析.克拉维酸血样预处理)取血浆样品 加入 乙腈涡旋 、离心 )转移上清液置干净的离心管中加入二氯甲烷 涡旋 、离心 第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究)取上层液体加入正己烷 涡旋 、离心 )取下层水相.滤头过滤后进样分析.方法学验证.专属性 阿莫西林:取 只不同犬的空白血浆样品、空白血浆加 阿莫西林标准溶液空白血浆加 克拉维酸标准溶液空白血浆加内标工作液按.节方法处理样品后检测克拉维酸:取 只不同犬的空白血浆样品、空白血浆加 阿莫西林标准溶液空白血浆加 克拉维酸标准溶液按.节方法处理样品后检测.标准曲线及线性分析 取空白血浆 分别加入相应浓度的阿莫西林系列标准工作液 制成、的阿莫西林标准曲线血浆样品取空白血浆 分别加入相应浓度的克拉维酸系列标准工作液 制成、和 的克拉维酸标准曲线血浆样品 按.节方法处理后进样检测以阿莫西林浓度()为横坐标峰面积比值()为纵坐标绘制阿莫西林标准曲线 以克拉维酸样品浓度()为横坐标克拉维酸峰面积()为纵坐标绘制克拉维酸标准曲线 种分析物标准曲线计算均采用加权(/)最小二乘法线性回归分析.准确度和精密度 取空白血浆 分别加入相应浓度的阿莫西林质控工作液 制备阿莫西林质量浓度为、的质控样品取空白血浆 分别加入相应浓度的克拉维酸质控工作液 制备克拉维酸质量浓度为、的质控样品 每个浓度 个平行样品连续制备并测定 个分析批根据当日的标准曲线方程求得质控样品浓度计算准确度、批内()及批间()精密度.基质效应 空白基质加标样品制备:取 只不同犬的空白血浆用乙腈沉淀蛋白并涡旋离心后取全部上清液分别加入低、高浓度质控工作液(阿莫西林样品加内标工作液)再按.节方法继续处理每个浓度 个平行样品 纯溶液样品制备:以超纯水替换空白血浆其余步骤相同 记录检测空白基质加标样品的阿莫西林峰面积为 内标峰面积为 检测纯溶液样品的阿莫西林峰面积平均值为 内标峰面积平均值为 计算经内标归一化的基质因子(/)/(/)及其精密度 记录检测空白基质加标样品的克拉维酸峰面积为 纯溶液样品的克拉维酸峰面积平均值为 计算基质因子(/)及其精密度.稀释可靠性 制备 的阿莫西林血浆样品用空白血浆稀释 倍制备 的克拉维酸血浆样品用空白血浆稀释 倍 每种药物各制备 个平行样品分别按.节方法处理后检测 根据当日的标准曲线获得稀释后样品的检测浓度将检测浓度乘以稀释倍数与制备浓度比较计算准确度和精密度.稳定性 对低、中、高浓度的质控样品进行如下条件的稳定性考察:血浆样品 反复冻融 次的稳定性血浆样品 长期放置(克拉维酸和阿莫西林血浆样品分别放置 和 )的稳定性预处理后样品进样室放置 稳定性阿莫西林血浆样品室温放置 稳定性和克拉维酸血浆样品 放置 稳定性.药动学试验采用单剂量、双处理、双周期交叉试验设计选 只成年健康比格犬随机分为 组(和 组)每只受试犬进行 个周期试验各服用 次受试制剂()和 次参比制剂()每次服用半片(含阿莫西林 克拉维酸 )清洗期设置为 受试犬给药前禁食 除给药前 和给药后 禁止饮水外任意饮水 次日早晨空腹取血样后给犬口服受试制剂或参比制剂并灌服 水促其吞服 后统一饲喂犬维持饲料 分别在口服给药前及给药后 、.、.、.、.、.、.、和 于犬的前肢静脉采集血液.采集的血样在预冷的离心机()以 离心 分离的血浆转移至干净的离心管中置于 冰箱冷冻保存待测 阿莫西林血浆样品检测时间点为给药前和给药后 、.、.、.、和 克拉维酸血浆样品检测时间点分别为给药前和给药后 、.、.、.、.、.、.、和 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷.数据处理与分析采用 .药动学软件以非房室模型分析药动学血浆样品的浓度数据获得药动学参数对参比制剂和受试制剂药动学参数峰值浓度、药物浓度时间曲线下面积 和 对数转换后进行方差分析及双向单侧 检验并计算 置信区间范围达峰时间 需经非参数检验进而评价生物等效性图 血浆中阿莫西林和内标(阿莫西林)的典型 色谱图 ().空白血浆 .空白血浆添加 克拉维酸标准溶液 .空白血浆添加 内标工作液 .空白血浆添加 阿莫西林标准溶液 .结果与分析.方法学验证结果.专属性 从图 可以看出阿莫西林的保留时间约为.内标的保留时间约为.从图 可以看出克拉维酸的保留时间约为.以上结果表明来源不同的空白基质中分析物保留时间处无杂峰干扰且各分析物之间无相互干扰方法专属性良好 第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究图 血浆中克拉维酸的典型 色谱图 .空白血浆 .空白血浆添加 阿莫西林标准溶液 .空白血浆添加 克拉维酸标准溶液 .标准曲线和线性 犬血浆中阿莫西林在 浓度范围内线性关系良好其回归方程为.(.)犬血浆中克拉维酸在 浓度范围内线性关系良好其回归方程为.(.).准确度和精密度 由表 可见阿莫西林和克拉维酸质控样品的准确度均在标示值的 范围内批内()、批间()精密度均小于 表明该方法检测重复性良好表 方法的准确度和精密度结果 分析药物添加浓度/()平均准确度/批次 批次 批次 批内精密度/批次 批次 批次 批间精密度/阿莫西林克拉维酸.基质效应 阿莫西林在低、高浓度下经内标归一化后基质因子的平均值分别为.、.分别为.、.克拉维酸在低、高浓度下基质因子的平均值分别为.、.分别为.、.表明不同来源的血浆基质对阿莫西林和克拉维酸的测定结果没有影响.稀释可靠性 阿莫西林稀释样品检测的准确度为.为.克拉维酸稀释样品检测的准确度为.为.表明该稀释方法不影响样品检测的准确度和精密度.稳定性考察结果 血浆中药物稳定性考察结果见表 结果显示血浆中药物浓度检测的准确度均在 范围内 小于 表明血浆样品中阿莫西林和克拉维酸在不同储存条件下稳定性良好.药物的药动学参数共有 只受试犬完成试验 只受试犬因呕吐时间在 倍中位达峰时间()内而退出试验 采用南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 .药动学软件的非房室模型计算得到 只犬单剂量口服阿莫西林克拉维酸钾片受试制剂和参比制剂后平均药动学参数结果见表 绘制的平均血药浓度时间曲线如图 所示表 不同条件下犬血浆中阿莫西林和克拉维酸的稳定性检测结果()()分析药物储存条件 添加浓度/()检测浓度/()平均准确度/精密度/阿莫西林克拉维酸 反复冻融 次 长期放置 室温放置 进样室放置 反复冻融 次 长期放置 放置 进样室放置 .表 犬口服阿莫西林和克拉维酸受试制剂和参比制剂后的药动学参数()()药动学参数阿莫西林 参比制剂 受试制剂 克拉维酸 参比制剂 受试制剂/././()./()./()././()./()./.注:达峰时间 /:消除半衰期 :峰值浓度 :药物浓度时间曲线下面积 :消除速率常数 :生物利用度:清除率 :表观分布容积 :平均驻留时间 .药物的生物等效性分析将阿莫西林和克拉维酸主要药动学参数、及 对数转换后进行方差分析结果见表 两制剂间各参数均无显著差异(.)双向单侧 检验结果表明 和 均大于单侧.几何平均值的 置信区间均在 等效范围内经非参数检验在受试制剂和参比制剂间无统计学差异(.)表明两制剂生物等效 第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究图 犬口服参比制剂()或受试制剂()后阿莫西林和克拉维酸平均血药浓度时间曲线()()()()表 受试制剂()和参比制剂()主要药动学参数经对数转换后几何平均值()比值的 置信区间 ()()()分析药物参数 比值(/)/(/)置信区间/阿莫西林克拉维酸 .讨论本文首先建立了一种准确、便捷的犬血浆中阿莫西林和克拉维酸浓度测定的/法 阿莫西林是两性化合物结构式中有氨基和羧基在电喷雾离子源()的正离子()和负离子()模式下均有响应 克拉维酸的结构式中仅有羧基难以带正电荷仅在 模式下有响应 文献报道中应用/监测阿莫西林和克拉维酸一般有 种方式:一种是分开检测阿莫西林应用 模式而克拉维酸应用 模式另一种是在 模式下同时监测阿莫西林和克拉维酸 同时监测 种成分能大大缩短分析时间因此本试验开始时首选这一方式 而试验过程中发现模式下当克拉维酸浓度为 时阿莫西林和克拉维酸之间互不干扰均能准确定量但当克拉维酸浓度超过 时对阿莫西林的响应有抑制作用目前未见有文献报道这一现象这可能与生物样品基质或质谱型号有关 在生物等效性试验中方法的定量准确为必要条件而这种抑制现象影响样品检测的准确度考虑到阿莫西林在 模式下的响应远低于 模式因此最终选择应用 模式监测阿莫西林模式监测克拉维酸 在 模式下在流动相中加入甲酸可促进阿莫西林分子的离子化增强其响应因此在仪器允许条件下甲酸添加量至.而 模式下降低甲酸的含量能使克拉维酸获得更好的峰型和更高的响应因此在克拉维酸流动相条件中将甲酸水溶液中甲酸的含量调至.阿莫西林和克拉维酸均选择梯度洗脱模式当初始比例中含有机相时分析物峰形变差响应减弱因此初始比例中乙腈比例为 根据 等报道的血浆样品前处理方法以乙腈沉淀样品中蛋白后直接用超纯水稀释后进样 我们在重复该处理方法时发现处理后的样品中乙腈含量较高时阿莫西林和克拉维酸均出现响应减弱色谱峰分叉、分裂的现象因此选择在乙腈沉淀蛋白后加入二氯甲烷萃取乙腈取水层分析峰型明显改善且响应也明显提高 在本文建立的方法下阿莫西林定量限血浆浓度为 进样分析浓度低至 比 等、等和 等报道方法的灵敏度更高 克拉维酸经二氯甲烷去除乙腈后进样分析发现基线噪声较高而影响定量限和低浓度样品的定量经筛选考察后发现二氯甲烷去除乙腈取水层添加同体积正己烷涡旋除脂可降低出峰处的基线噪声提高样品检测准确度和灵敏度南 京 农 业 大 学 学 报第 卷本文阿莫西林检测方法中选择同位素内标(阿莫西林)由于其具有相同的结构和性质可有效消除基质效应提高准确度和精密度及稳定性 此外基于克拉维酸高浓度下对阿莫西林响应存在抑制作用而给药后克拉维酸的 远高于 故未选用阿莫西林 为内标且无内标条件下克拉维酸定量检测的准确度和精密度良好 经方法学验证本研究建立的犬血浆中阿莫西林、克拉维酸浓度的检测方法均特异性强、准确度高、精密度好适用于犬口服阿莫西林克拉维酸钾片的生物等效性测定犬分别经单剂量(阿莫西林 克拉维酸 )口服受试制剂和参比制剂后受试制剂阿莫西林、克拉维酸的平均血药浓度时间曲线与参比制剂基本吻合显示两制剂口服后在犬体内的药动学行为基本一致 经药动学软件分析获取主要药动学参数、和 并将其对数转化方差分析结果表明阿莫西林和克拉维酸的主要药动学参数在受试和参比制剂间差异均不显著双向单侧 检验符合要求且几何平均值比(/)的 置信区间均在.规定范围内经非参数分析后无统计学差异 按照兽用化学药品血药浓度法生物等效性试验指导原则和中国药典(年版)四部附录 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则规定可以判定受试制剂和参比制剂生物等效参考文献:陈杖榴曾振灵.兽医药理学.第 版.北京:中国农业出版社:.:().张仲秋丁伯良.默克兽医手册.第 版.北京:中国农业出版社:.:().兽药手册.沈建忠冯忠武曹兴元译.北京:中国农业大学出版社:.:().马衍平.阿莫西林/克拉维酸钾对犬的安全性与临床效果试验的研究.南京:南京农业大学./.:().():.中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国农业农村部公告第 号/.().:/././.().:/./.().():/.():.():.郭佩佩姚宇秀王艳菲等.高效液相色谱法检测乳中 内酰胺酶抑制剂:克拉维酸.中国食品学报():.:.():().宋昕昊林梦娟左儒楠等.小鼠血浆中马度米星铵超高效液相色谱串联质谱检测方法的建立.畜牧与兽医():.():().(/):.中华人民共和国农业农村部兽药评审中心.关于发布兽用化学药品血药浓度法生物等效性试验技术指导原则等 个指导原则的通知.().国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部).北京:中国医药科技出版社:.().:().责任编辑:周广礼