RNA剪接中的SF3B1功能及其磷酸化修饰的研究进展.pdf

综 述R N A剪接中的S F 3 B 1功能及其磷酸化修饰的研究进展*刘畅晓风,方秋月,谢微嫣(首都医科大学 北京市神经外科研究所 细胞生物室,北京1 0 0 0 7 0)摘要 R NA剪接作为真核生物基因表达的关键环节,通过去除前体mR NA中的内含子并将外显子连接,对基因表达调控起到了至关重要的作用。此过程主要由剪接体复合物介导,而剪接体的组装和激活则主要依赖剪接因子的促进,从而协助完成两个步骤的酯交换。剪接因子3 B亚基1(s p l i c i n g f a c t o r 3 B s u b u n i t 1,S F 3 B 1)是组成剪接体复合物的U 2 R N P的关键部分,其磷酸化修饰水平改变细胞剪接过程,进而对正常细胞功能或肿瘤细胞的增殖、迁移等产生影响。本文总结了迄今为止磷酸化蛋白组学中关于S F 3 B 1的部分,重点关注S F 3 B 1在剪接中的功能以及磷酸化修饰对其功能影响的研究进展。关键词 R NA剪接;剪接体;S F 3 B 1;S A P 1 5 5;磷酸化中图分类号 Q 5 2 2;R 3 4A d v a n c e s i n t h e F u n c t i o n a l R o l e o f S F 3 B 1 i n R N A S p l i c i n g a n d i t s P h o s p h o r y l a t i o n M o d i f i c a t i o n s*L I U C h a n g-X i a o-F e n g,F ANG Q i u-Y u e,X I E W e i-Y a n(D e p a r t m e n t o f C e l l B i o l o g y,B e i j i n g N e u r o s u r g i c a l I n s t i t u t e,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 7 0,C h i n a)A b s t r a c t R NA s p l i c i n g,a c r i t i c a l p r o c e s s i n e u k a r y o t i c g e n e e x p r e s s i o n,p l a y s a f u n d a m e n t a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n b y r e m o v i n g i n t r o n s f r o m p r e c u r s o r mR NA a n d j o i n i n g e x o n s.T h i s p r o c e s s i s p r i m a r i l y m e d i a t e d b y t h e s p l i c e o s o m e c o m p l e x,w h i l e t h e a s s e m b l y a n d a c t i v a t i o n o f t h e s p l i c e o s o m e p r e d o m i n a n t l y r e l y o n s p l i c i n g f a c t o r s,f a c i l i t a t i n g t h e t w o-s t e p t r a n s e s t e r i f i c a t i o n.T h e s p l i c i n g f a c t o r 3 B s u b u n i t 1(S F 3 B 1)o c c u p i e s a c r u c i a l p o s i t i o n w i t h i n t h e U 2 R N P t h a t c o n s t i t u t e s t h e s p l i c e o s o m e c o m p l e x.A l t e r n a t i o n s i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n l e v e l o f S F 3 B 1 a f f e c t t h e c e l l u l a r s p l i c i n g p r o c e s s,s u b s e q u e n t l y i n f l u e n c i n g n o r m a l c e l l f u n c t i o n,a s w e l l a s t h e p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n o f t u m o r c e l l s.T h i s a r t i c l e s u mm a r i z e s t h e r e s e a r c h t o d a t e o n S F 3 B 1 w i t h i n t h e c o n t e x t o f p h o s p h o p r o t e o m i c s,w i t h p a r t i c u l a r e m p h a s i s o n t h e r o l e o f S F 3 B 1 i n s p l i c i n g a n d t h e i m p a c t o f p h o s p h o r y l a t i o n m o d i f i c a t i o n s o n S F 3 B 1.K e y w o r d s R NA s p l i c i n g;s p l i c e o s o m e;S F 3 B 1;S A P 1 5 5;p h o s p h o r y l a t i o n引用格式:刘畅晓风,方秋月,谢微嫣.R NA剪接中的S F 3 B 1功能及其磷酸化修饰的研究进展.生理科学进展,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8.L I U C h a n g-X i a o-F e n g,F AN G Q i u-Y u e,X I E W e i-Y a n.A d v a n c e s i n t h e F u n c t i o n a l R o l e o f S F 3 B 1 i n R NA S p l i c i n g a n d i t s P h o s p h o r y l a t i o n M o d i f i c a t i o n s.P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8.D O I 1 0.2 0 0 5 9/j.c n k i.p p s.2 0 2 3.0 7.1 1 2 7收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 4;修回日期:2 0 2 3-0 4-2 3;接受日期:2 0 2 3-0 4-2 4*国家自然科学基金(8 2 0 7 1 5 5 9;8 2 0 7 1 5 5 8)资助课题 通信作者 w e i y a n x i e c c m u.e d u.c n153生理科学进展 P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s h t t p:/p h y s i o l.b j m u.e d u.c n O c t o b e r 2 5,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8 在生物体内,蛋白质合成是一个精确控制的过程,转录后修饰作为确保蛋白质的完整性、多样性和保真度的关键环节,发挥着至关重要的作用。其中,R NA剪接(R NA s p l i c i n g)是转录后修饰最核心的环节,其过程涉及从初始转录产物(mR NA前体)中移除非编码的内含子,并将外显子连接起来的过程。值得注意的是,绝大多数人类基因的剪接过程采用了选择性剪接,即在剪接过程中,会选择性包含或排除部分或全部编码性外显子,这种机制产生了两个或者多个亚型,使人类基因得以高效的方式实现多种功能。作为R NA剪接过程中的关键角色,S F 3 B 1基因表达的蛋白剪接因子3 B亚基1(s p l i c i n g f a c t o r 3 B s u b u n i t 1,S F 3 B 1)的功能调节很可能依赖磷酸化的调控。本文主要关注S F 3 B 1的突变研究现状、其表达蛋白S F 3 B 1磷酸化研究的进展、并整理这些突变或磷酸化改变对正常细胞和肿瘤细胞的功能影响。一、研究背景(一)R NA剪接主要由剪接体介导 R NA剪接过程除了极少数的一部分是通过自剪接进行的,其他绝大部分则由剪接体介导。剪接体是一种复杂的动态的R NA-蛋白质复合物,由多个组分组成,存在多个中间体复合物,每个剪接体复合物都是在p r e-mR NA的每个内含子上从头组装而成14。剪接体的组成部分可以大致分为五类:富含尿苷的小分子核糖核蛋白体(U 1、U 2、U 4、U 5和U 6 s n R N P s)、十九复合物(n i n e t e e n c o m p l e x,NT C)和NT C相关复合物(NT R)、剪接因子、R NA依赖的AT P酶/解旋酶,以及其他调节和/或辅助蛋白。在剪接过程中,不同的组分按照顺序或加入或离开剪接体复合物,据此可以将一个内含子剪接过程分成组装、激活、剪接、拆解四个阶段,而不同剪接体复合物中间体按照组装顺序可以分成E、p r e-B、B、Ba c t、B*、C、C*、P、内含子套索剪接体(i n t r o n l a r-i a t s p l i c e o s o m e,I L S)等中间体5。(二)U 2 s n R N P的结构 人类基因的R NA剪接多为可变剪接,R NA剪接是由一系列包含小核内核糖核蛋白(s n R N P s)的剪接体来执行的,R NA剪接中的关键步骤主要围绕p r e-mR NA的每一个内含子的三个重要结构进行:5 端剪接位点(5 s p l i-c i n g s i t e,5 S S)、分 支 点 序 列(b r a n c h p o i n t s e-q u e n c e,B P S)、3 端剪接位点(3 s p l i c i n g s i t e,3 S S)。虽然剪接本身是由R NA催化的,但剪接位点的正确识别依赖于R NA-R NA、R NA-蛋白质和蛋白质-蛋 白 质 的 相 互 作 用6。U 2 s n R N P在 选 择p r e-mR NA分支点序列保守腺苷中起着重要作用,该腺苷是剪接第一步的亲核底物;U 2 s n R NA具有显著的模块化设计,具有不同的结构域,可以与催化的U 6 s n R NA相互作用,识别内含子分支点序列,也担负着大型蛋白质组装的支架职责7。U 2 s n R N P包含如下成分:S F 3 A(1 2 5 k D a)、S F 3 B(3 6 0 k D a)和s n R NA 3 结合蛋白(1 3 0 k D a)(括号中为该蛋白质在酵母中的总分子量,这些蛋白质大多数在人类和酵母之间高度保守)以及U 2 s n R NA。S F 3 A/B是U 2小 核 核 糖 核 蛋 白(U 2 s n R N P)的主要组分。8S F 3 A是 由S F 3 A 1(S F 3 A 1 2 0)、S F 3 A 2(S F 3 A 6 6)和S F 3 A 3(S F 3 A 6 0)组 成 的 异 源 三 聚体7。S F 3 B由S F 3 B 1(S F 3 B 1 5 5)、S F 3 B 2(S F 3 B 1 4 5)、S F 3 B 3(S F 3 B 1 3 0)、S F 3 B 4(S F 3 B 4 9)、S F 3 B 5(S F 3 B 1 0)和S F 3 B 7(S F 3 B 1 4 b)组成9。冷冻电镜的结构数据揭示了酵母中这些蛋白质组分之间的相互关系:S F 3 B结构上包围U 2 R NA的分支点识别序列(B P R S),并在整个剪接体装配中与U 2 R NA-B P S双链相互作用1 0。H s h 1 5 5充当S F 3 B的骨架,并与大多数其他S F 3 B蛋白以及U 2 R NA-B P S双链相互作用,另外还和U 2蛋白C u s 2和P r p 5有较弱的相互作用1 11 7。综合以上线索,如图1所示,这些蛋白质通过连接S F 3 B亚复合物和3 结 合 蛋 白 连 接,实 现U 2 s n R NA的5 和3 区域互连。此外,人类的S F 3 B 1与酵母H s h 1 5 5结构上也有所不同,H s h 1 5 5主要由2 0个HE AT重复序列组成,而S F 3 B 1在HE AT重复N端侧还具有与其他蛋白质相互作用的结构域,包括 五 个 串 联 的U 2 A F配 体 基 序(U 2 A F l i g a n d m o t i f s,U LM s),这些结构域能与其他剪接因子(例如S F 1和U 2 A F 1/21 4,1 8)结合。图1 s n R N P内部各组分相互作用示意图253生理科学进展 P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s O c t o b e r 2 5,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8 (三)剪接因子翻译后修饰对剪接的调节 从四个阶段的命名可以看出,只有部分剪接体复合物中间体具有催化剪接的活性,激活剪接体复合物的催化活性显然是一个受到精细调控的过程。细胞依赖于信号转导通路来确保其各项功能的有序运行,这为细胞提供了一种快速、可调节的方式来适应环境变化。在各种人类疾病中,R NA剪接的异常改变常常成为关键的病因,这通常是通过调节可变剪接,即改变受影响基因的正常剪接调控中所需的顺式作用元件或反式作用因子来实现的。剪接体中的蛋白质成分可以根据功能分为四种不同的组分:结构蛋白、剪接因子、R NA依赖的AT P酶/解旋酶和其他调节蛋白1 9,剪接因子就是主要的一大类反式作用因子,剪接因子促进剪接体的组装和激活,并协助剪接过程中酯交换的两个步骤,选择性剪接要求精准识别外显子和内含子交汇区的基因序列,剪接因子的突变则会破坏原有调控导致异常转录,进而改变成千上万基因的剪接产物,破坏下游众多生理进程。异常的剪接结果包括转录的减少(或增加)、外显子跳跃、内含子滞留以及错误剪接位点导致的截短(或增长)外显子。体细胞突变而导致的R NA剪接异常在人类肿瘤的病理生理发展中发挥重要作用,受影响的基因往往无需发生突变,就会产生分布及功能的改变。在R NA剪接过程中,许多蛋白质在体内被磷酸化2 0,这是蛋白质翻译后修饰最常见且最重要的形式之一,这些磷酸化会调节剪接体内的蛋白质-蛋白质相互作用,从而有助于剪接过程中剪接体的动态结构重组2 1。二、剪接因子3 B亚基1研究现状(一)S F 3 B 1的 结 构 与 功 能 S F 3 B 1也 叫S A P 1 5 5,是主要剪接体U 2 s n R N P中的一个多蛋白S F 3 B因子的组成部分2 2;S F 3 B 1全长1 3 0 4氨基酸,C端存在HE AT(H u n t i n g t i n,e l o n g a t i o n f a c-t o r 3,a s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A,P I 3 k i-n a s e t a r g e t o f r a p a m y c i n 1)结构域重复区是S F 3 B复合物中R NA和蛋白质结合的中心区域,N端有富T P区,在酵母中的同源物为H s h 1 5 5;在S F 3 B所有亚基中以S F 3 B 1最保守,暗示其功能对生物体是十分关键的2 3。S F 3 B 1基因突变是剪接体基因中最常见的突变,在血液病和实体癌中均有显著的S F 3 B 1突变率,包 括 泌 乳 素 瘤2 4、骨 髓 增 生 异 常 综 合 征(MD S)2 5、慢性淋巴细胞白血病(C L L)2 6、葡萄膜黑色素瘤和乳腺癌等肿瘤中都有发现。在各种肿瘤中,S F 3 B 1的突变通常位于C端的HE AT重复结构域(氨基酸第6 2 27 8 1位),在C L L中较为常见如E 6 6 2 D、K 6 6 6 N、K 7 0 0 E、G 7 2 4 D2 7。在葡萄膜黑色素瘤中,R 6 2 5是主要的突变,可以检测到几种突变形式,包括R 6 2 5 C、R 6 2 5 G、R 6 2 5 H和R 6 2 5 L2 8。HE AT重复结构域负责多重功能,这个区域的突变会产生多种结果,比如,如果突变出现在B P S下游与内含子相互作用的区域,会影响剪接体与前体mR NA的结合,还可能导致剪接体使用正确3 剪接位点上游的隐藏3 剪接位点、选择其他分支点、影响S F 3 B 1和其他蛋白质之间的相互作用(例如P r p 5 和 S UG P 1)1 3。S F 3 B 1的多种突变影响细胞 各项生理进 程。W a n g等2 9发现S F 3 B 1突变促进了B R D 9中新增一个干扰性外显子,从而导致其mR NA降解,促进肿瘤生长;L i等2 4发现泌乳素瘤中存在S F 3 B 1的R 6 2 5 H热点突变,该突变会导致雌激素相关受体(e s t r o g e n r e l a t e d r e c e p t o r g a mm a,E R R g a mm a)异常剪接,在3 S S上游保留了一部分内含子,从而加强E R R g a mm a与垂体特异性正转录因子1(p i t u i t a-r y s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 1,P i t-1)的结合,进而促进P R L过量分泌。临床表现为该突变患者具有更高的泌乳素水平,更短的无进展生存期;L i u等2 7发现S F 3 B 1突 变 会 增 加P P 2 A磷 酸 酶 亚 基P P P 2 R 5 A的 转 录 本 衰 减,增 加c-MY C S 6 2和B C L 2 S 7 0的磷酸化,进而分别促进癌基因m y c编码蛋白的稳定性和抑制细胞凋亡。以上三个研究分别表明了S F 3 B 1突变可能导致新增(毒性)外显子、保留内含子、降低转录本水平,进一步说明S F 3 B 1在剪接过程中起着举足轻重的作用。(二)S F 3 B 1的磷酸化位点 除了S F 3 B 1的氨基酸突变,S F 3 B 1的磷酸化改变(包括氨基酸突变间接改变)也会影响S F 3 B 1的功能,本文整理了迄今为止研究发现的S F 3 B 1磷酸化位点,绘制了这些位点的分布情况(图2),它们均位于N端区域,下面按照所涉及的已知功能区域进行介绍(功能区域来自于U n i P r o t K B/S w i s s-P r o t)。1.S F 3 B 1磷酸化位点的发现和研究:2 0 0 2年,B o u d r e z等3 0通过蛋白质水解衍生的磷酸肽测序技术确定了细胞周期蛋白E-细胞周期蛋白依赖激酶2(C d k 2)会 磷 酸 化S F 3 B 1,位 点 为T 2 4 4、T 2 4 8和353生理科学进展 P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s h t t p:/p h y s i o l.b j m u.e d u.c n O c t o b e r 2 5,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8T 3 1 3。进一步地,B e a u s o l e i l等3 1在2 0 0 6年提出了一种基于概率的A s c o r e评分,通过使用串联质谱仪测定碎片离子质谱,并依据中位点确定离子存在情况及其信号强度,从而更准确地定位磷酸化位点。他们从诺可达唑抑制的H e L a细胞裂解物的4 9 1个蛋白质中鉴定出1 7 6 1个非冗余磷酸化位点,肽假阳性率为1.3%,其中S F 3 B 1磷酸化位点为:T 2 0 7、T 2 1 1、T 3 2 8。同年1 1月,O l s e n等3 2用表皮生长因子(e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r,E G F)刺激H e L a细胞后在2 2 4 4个蛋白质上检测到了6 6 0 0个磷酸化位点,其 中 发 现S F 3 B 1上 磷 酸 化 位 点 如 下:T 2 1 1、T 2 2 3、T 2 9 6、T 2 9 9;2 0 0 7年,Y u团队3 3使用改进的T i O 2富集程序,从H e L a细胞中鉴定了总共8 5 8种磷酸肽,对应于1 0 3 4个不同的磷酸化位点,鉴定到的S F 3 B 1位 点为T 1 4 2、T 2 2 3;2 0 0 8年,D e p h o u r e等3 4针对一个停滞在G 1期和M期的人类细胞系,检测和鉴定了受细胞周期调节的蛋白质磷酸化情况,其 中S F 3 B 1磷 酸 化 位 点:S 1 2 9、T 1 4 2、S 1 9 4、T 2 0 7、T 2 1 1、T 2 2 3、T 2 2 7、T 3 2 6、T 3 2 8、S 3 3 2、S 4 8 8;2 0 1 0年,O l s e n等3 5应用基于高分辨率质谱的蛋白质组学在全球范围内研究人类细胞周期的蛋白质组和磷酸 化 蛋 白 质 组,并 量 化 了6 0 2 7种 蛋 白 质 和2 0 4 4 3个独特的磷酸化位点及其动力学变化,发现了S F 3 B 1上 的 磷 酸 化 位 点:S 1 2 9、S 1 9 4、T 2 0 3、T 2 0 7、T 2 1 1、T 2 2 3、T 3 2 6、T 3 2 8和S 4 8 8;2 0 1 2年,G i r a r d 等3 6分离了催化激活的人剪接体,并通过质谱鉴定了活性剪接体特异性的S F 3 B 1磷酸化位点S 1 2 9、T 2 1 1、T 2 3 5、S 2 4 2、T 2 4 8、S 3 2 2、T 3 2 6和T 3 2 8;2 0 1 3年,Z h o u等3 7开发了一种高分辨率和高灵敏度的H I L I C分离,以及基于T i4+-I MA C的少偏 磷 酸 肽 富 集 方 法。利 用T i4+-I MA C富 集(1 D)、T i4+-I MA C富 集 然 后H I L I C分 馏(2 D)、S C X-T i4+-I MA C然后H I L I C分馏(3 D)三种策略对两种人类癌细胞系(H e L a和K 5 6 2)进行了磷酸化蛋白质组学分析,分别产生1 7 0 0 0个和近2 4 0 0 0个独特磷酸化位点的磷酸化蛋白质组资源。其中在H e L a细胞系的S F 3 B 1上发现了S 1 2 9、T 1 4 2、S 1 9 4、T 2 0 7、T 2 1 1、T 2 2 3、T 2 2 7、T 2 3 5、T 2 5 7、T 2 6 1、T 2 6 7、T 2 7 8、T 2 9 6、T 3 0 3、T 3 1 3、T 3 2 6、T 3 5 0、S 4 0 0、T 4 2 6、T 4 3 4、T 4 3 6和S 4 8 8共2 2个 磷 酸 化 位 点。Z h o u等3 7在K 5 6 2细胞系进行了磷酸化蛋白质组学分析,有趣的是,在H e L a细胞系中存在的S F 3 B 1 2 2个磷酸化位点均在K 5 6 2细胞系中可检测到,而K 5 6 2细 胞 系 中 还 检 测 到 有T 1 2 5、S 2 8 7、T 3 1 6、S 3 2 2、S 3 3 2、T 3 4 1、T 3 5 4共7个 位 点。2 0 0 9年,M a y y a等3 8使用人类J u r k a t T细胞白血病细胞系作为模型系统,并对T细胞受体(T C R)信号进行大规模定量磷酸化蛋白质组分析。其中鉴定到S F 3 B 1上的 磷 酸 化 位 点 为:T 2 0 7、T 2 1 1、T 2 2 3、T 2 2 7、T 3 2 6、T 3 4 1、S 3 4 9、T 3 5 0、S 4 0 0、T 4 3 4、T 4 3 6。2 0 1 1年,R i g b o l t等3 9对人胚胎干细胞(h E S C s)进行了平行的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析,共分析了6 5 2 1个蛋白质和2 3 5 2 2个磷酸化位点,其中S F 3 B 1的 磷 酸 化 位 点 为:S 1 2 9、T 2 1 1、T 3 4 1、S 3 4 4、S 3 4 9、T 3 5 4。2 0 1 4年,B i a n等4 0开发了一种酶辅助反相-反相液相色谱(R P-R P L C)方法,进一步提高了磷酸化蛋白质组的覆盖率,最终从正常人肝组织中鉴定出总共2 2 4 4 6个磷酸化位点,相当于6 5 2 6个 非 冗 余 磷 酸 化 蛋 白 质。在 这 些 位 点 中,1 5 2 2 9个位点A s c o r e 1 3,其中S F 3 B 1的位点如下:S 1 2 9、T 2 1 1、T 2 5 7、T 2 6 1、T 2 6 7、T 2 7 3、T 2 7 8、S 2 8 7、T 3 0 3、T 3 1 3、S 4 8 8。总的来说,磷酸化蛋白质组学的研究者们通过不断改进测定方法和评分体系,积累了丰富的磷酸化组学数据。本文特别关注于S F 3 B 1的磷酸化位点,这些位点都集中在其N端区域。2.无序区(1 2 4-1 4 8)磷酸化位点:蛋白质无序区域是指由氨基酸序列定义的蛋白质分子的一部分,此区域并未形成稳定的结构,因此具有高度动态性和变异性。众多研究已经揭示蛋白质无序区域在生物过程中扮演着重要的角色4 1。包括已发现的位点T 1 2 5、S 1 2 9、T 1 4 2,其中S 1 2 9在H e L a、K 5 6 2、人胚胎干细胞、正常人肝组织中都存在磷酸化。3.U 2 A F 配体基序(1 9 0-3 4 2)磷酸化位点:U 2 s n R N P 辅 助 因 子(U 2 s n R N P a u x i l i a r y f a c t o r,U 2 A F)配体基序(U LM s)负责蛋白质-蛋白质之间的相互作用,通过与U 2 s n R N P 辅助因子辅助基序(UHM s)识别结合,实现蛋白质间的非共价连接,S F 3 B 1的N端上有5个U LM s,分别位于1 9 2-2 0 4、2 1 0-2 2 2、2 2 4-2 3 6、2 8 5-2 9 7、3 3 0-3 4 24 2。包 括 已 发现 的 位 点S 1 9 4、T 2 0 3、T 2 1 1、T 2 2 7、T 2 3 5、S 2 8 7、T 2 9 6、S 3 3 2、T 3 4 1。将迄今为止发现的S F 3 B 1磷酸化位点进行频数统计(图3),可以看到被检测到存在磷酸化频数最高的是2 1 1位的T h r残基,它在所有被统计文献、来源组织中均有磷酸化,这一位点在人类不同组织细胞中始终保持其磷酸化水平,其负责的功能或产生的意义还待进一步研究揭示。453生理科学进展 P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s O c t o b e r 2 5,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8图2 迄今为止发现的S F 3 B 1磷酸化位点分布示意图 图3 磷酸化位点研究发现的S F 3 B 1磷酸化位点统计横坐标为磷酸化位点序号、氨基酸,纵坐标为该位点被检测到的次数,其中图例显示发现该位点的样本来源 (三)S F 3 B 1磷酸化的影响和对应激酶的 研究 S F 3 B 1在其N末端包含大量的C D K、糖原合酶激酶3(G S K 3)和丝裂原活化蛋白激酶的共有位点,这些位点主要是丝氨酸或苏氨酸残基,且相邻的+1位置存在脯氨酸,构成了脯氨酸定向激酶磷酸化的潜在可能位点;这些位点在剪接途径的催化步骤I I之前被磷酸化,暗示了C D K可能的调控作用。S e g h e z z i等4 3实验证明细胞周期蛋白E/C D K 2在体外磷酸化S F 3 B 1,而这种磷酸化可以被C D K特异性抑制剂p 2 1所抑制。这一结果证实了前mR-NA剪接可能与哺乳动物细胞中的细胞周期机制存在联系。d e G r a a f等4 4的实验数据显示,在C O S-7细胞系中,S F 3 B 1上的T h r 4 3 4这个位点是体内反应中主要的磷酸化位点。在体外实验中,这个位点主 要 由 双 特 异 性 酪 氨 酸 磷 酸 化 调 节 激 酶1 A(D Y R K 1 A)磷酸化,D Y R K 1 A是一种靶向丝氨酸/苏氨酸/脯氨酸残基的激酶4 5,它能够有效地磷酸化S F 3 B 1上的富含T P的结构域内的多个位点,这些位点也被C O S-7细胞中的内源性激酶磷酸化;这些发现暗示了D Y R K 1 A可能参与前mR NA剪接的调节,确定D Y R K相关激酶在这些条件下的作用以及它们可能对剪接体的功能产生的影响还需要进一步研究。此外,B o u d r e z等3 0的研究发现细胞周期蛋白B-C d k 1和细胞周期蛋白E-C d k 2能够作为S F 3 B 1激酶,并且能够靶向T 2 4 4、T 2 4 8和T 3 1 3进行磷酸化,依赖于这些S F 3 B 1的富T P片段的磷酸553生理科学进展 P r o g r e s s i n P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s h t t p:/p h y s i o l.b j m u.e d u.c n O c t o b e r 2 5,2 0 2 3,5 4(5)3 5 13 5 8化位 点,蛋 白 磷 酸 酶1核 内 抑 制 剂(N I P P 1或P P P 1 R 8)的叉头相关(F HA)结构域可以在体外和体内与剪接因子S F 3 B 1的富T P片段相互作用;随后确定P P P 1 R 8的F HA结构域仅存在与一个磷酸化位点结合的部位,T 2 4 4、T 2 4 8和T 3 1 3这三个位点的磷酸化会与F HA结构域竞争结合,其中T 3 1 3位点磷酸化竞争效率高于另外两个位点。S F 3 B 1与N I P P 1结合后会引导向蛋白磷酸酶-1(P P 1)4 6,P P 1和磷酸酶P P 2 A合作使S F 3 B 1去磷酸化,这也是剪接过程的第二步4 5。G i r a r d等3 6使用有丝分裂停滞来同步化两种人类细胞系H e L a和K 5 6 2,并测量S F 3 B 1表达和丝氨酸/苏氨酸磷酸化(使用抗磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸-脯氨酸:p S e r/T h r-P r o和抗磷酸苏氨酸3 1 3:p S F 3 B 1)。他们发现,在细胞周期进程中S F 3 B 1呈现出高度动态的磷酸化模式,其中S F 3 B 1磷酸化水平在G 1期低,在G 1/S期进一步下降,但在G 2/M期高度磷酸化。M u r t h y 等4 7提出假说,认为G 2/M期S F 3 B 1的磷酸化水平上升归因为C D K 1的活性,而随后在有丝分裂结束后S F 3 B 1磷酸化的降低是由重新进入G 1期时活跃的磷酸酶介导的。为了验证这一假说,他们首先用特异C D K 1(C D C 2)抑制剂p u r v a l a n o l A处理停滞在G 2/M期的H e L a和K 5 6 2细胞,从而阻断了S F 3 B 1上所有可被检测到的磷酸化;接着,他们使用冈田酸(o k a d a i c a c i d,OA)处理抑制G 1/S期细胞中的磷酸酶活性,结果发现S F 3 B 1磷酸化增加。这些结果验证了他们的假说,即:S F 3 B 1磷酸化在细胞周期进程中是动态的,以C D K依赖的方式在G 2/M期达到峰值,然后随着细胞通过G 1/S期,由于磷酸酶活性而降低。糖原合酶激酶3(G S K-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,在所有真核生物中都存在,参与调节广泛的细胞过程,它的失调与许多人类疾病有关,包括心脏病、糖尿病、阿尔茨海默病、双相情感障碍和癌症等。W a n g等4 8的研究报道了糖原合酶激酶3经过一氧化氮介导的S-亚硝基化后可以磷酸化S F 3 B 1。在Wu等4 9的研究中,他们发现,那些会加速蛋白质周转(分解和合成)的磷酸化位点,通常与细胞适应性功能相关,这些位点往往是周期蛋白依赖性激酶的底物,这意味着,不同蛋白质上的不同磷酸化位点可能会对它们的寿命产生广泛的影响。研究者采用了一种配对策略:从各自磷酸肽(p-肽)的半衰期(T1/2)中 减 去 非 磷 酸 化 肽(n p-肽)的 半 衰 期(T1/2),得到一个差值(T1/2 半衰期的差值)。通过这种方式,他们精确衡量了蛋白质磷酸化对蛋白质寿命的影响。他们发现,大部分蛋白质在磷酸化后,会降低该蛋白质的周转率,从而增强了蛋白质表达的稳定性。他们测量的S F 3 B 1的所有1 9种磷酸化修饰形式与非磷酸化的对应物相比,寿命几乎没有差异。这表明,尽管S F 3 B 1进行了磷酸化修饰,快速的动态磷酸化与去磷酸化消除了这些差异。最近,H l u c h等5 0报道周期蛋白依赖性激酶1 1(C D K 1 1)会结合并磷酸化S F 3 B 1的N端部分,并由此调控剪接体中间体复合物的转变,从而影响共转录剪接。他们的实验证明了先前发现T 2 3 5、T 3 1 3、T 3 2 8位 点 磷 酸 化 依 赖 于C D K 1 1的 存 在。H l u c h团队首先证实了OT S 9 6 4是C D K 1 1的特异性抑制剂,随后在OT S 9 6 4存在的情况下进行了剪接体 中 间 体 的 动 力 学 分 析,发 现 缺 乏 磷 酸 化 的S F 3 B 1在核提取物中导致了剪接的停滞,并检测到未激活的B复合物 的形成。该结果 不 仅 证 实 了S F 3 B 1的磷酸化在剪接中的重要作用,同时也证明C D K 1 1在S F 3 B 1磷酸化中扮演着重要角 色。但C D K 1 1在 剪 接 调 节 中 的 进 一 步 作 用,以 及 通 过C D K 1 1抑制的剪接调节的治疗潜力还有待进一步探讨。总之,S F 3 B 1在体内存在着多位点多激酶的磷酸化修饰,这些磷酸化修饰在调控R NA剪接中起关键性作用,另一方面负责磷酸化S F 3 B 1的激酶都与细胞周期有关,这也符合S F 3 B 1的功能发挥时机与细胞分裂的密切联系。三、结语与展望本综述概述了关于剪接过程的一些背景知识,归纳和列举了磷酸化蛋白质组学中发现的S F 3 B 1磷酸 化 位 点,并 最 后 详 细 介 绍 了C D K 1、C D K 2、D Y R K 1 A与S F 3 B 1磷酸化的研究3 0,4 3,4 4、磷酸化与蛋白质寿命关系的研究4 9和最新磷酸化S F 3 B 1激酶C D K 1 1研究等进展5 0。剪接体负责前体mR NA的加工,其中非编码序列(内含子)被去除,编码序列(外显子)被连接在一起,这对于蛋白质表达至关重要。蛋白质表达事件主要在细胞需要增殖的时期发生,而细胞增殖则由复杂的蛋白质网络控制,