UPLC-QE-MS结合UPLC表征绿萼梅不同发育时期的成分差异及抗氧化活性研究.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1915-1928UPLC-QE-MS结合UPLC 表征绿萼梅不同发育时期的成分差异及抗氧化活性研究吴瑞，杨亚活，钱程程”，张伟1-2，欧金梅1.2 3*1安徽中医药大学药学院；中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，合肥2 30 0 12；3道地药材国家重点实验室，北京10 0 7 0 0摘要：梅花为蔷薇科植物梅Prunus mume（Si e b.）Si e b.e t Zu c c.的干燥花蕾，绿萼梅为临床人药的主要品种。该研究为明确不同发育时期绿萼梅的化学组成及差异，采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱（UPLC-QE-MS)检测其化学组成，共检测得到32 8 个化合物，包含6 7 个黄酮、50 个苯丙素、10 4个枯类、2 6 个酚类、2 4个生物碱、11个有机酸及其衍生物、8 个氨基酸衍生物及其他38 个化合物。半定量结果显示绿萼梅中主要化学成分的含量随发育时期呈逐渐下降趋势。采用紫外-可见分光光度法对不同发育时期绿萼梅样品中总黄酮和总苯丙素含量进行测定，采用UPLC法测定不同发育时期8 个指标性成分（新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷)含量，分析结果表明花蕾期与全开期之间成分含量差异显著，绿原酸可作为不同发育时期之间的差异质量标志物。DPPH自由基清除法检测不同发育时期绿萼梅的抗氧化活性,结果表明抗氧化能力与其成分含量密切相关,且随着花的发育逐渐减弱。该文结果可为梅花的化学成分动态变化规律和最佳采收期的确定提供分析方法和数据支撑。关键词：绿萼梅；发育时期；黄酮；苯丙素；抗氧化活性；绿原酸中图分类号：R284.1D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.11.010Compositional differences of Mume Flos at different developmental periodsby UPLC-QE-MS and UPLC and their antioxidant activityWU Rui,YANG Ya-tian,QIAN Cheng-cheng,ZHANG Weil-2,OU Jin-meil-2.3 2 Anhui Key Laboratory of New Manufacturing Technology of Chinese Medicine Pieces,Hefei 230012,China;Abstract:Mume Flos is the dried flower bud of Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.in the Rosaceae family,and the Prunusmume“Lve is the main species used in clinical medicine.In this study,the chemical composition of Mume Flos was deter-mined by ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry(UPLC-QE-MS)at dfferent developmental periods.A total of 328 compounds were detected,including 67 flavonoids,50 phenylpro-panoids,104 terpenoids,26 phenols,24 alkaloids,11 organic acids and their derivatives,8 amino acid derivatives and 38 oth-ers.The semi-quantitative results showed a gradual decrease in the content of the main chemical constituents in Mume Floswith the developmental period.The content of the total flavonoid and phenylpropanoid was determined by UV-Vis spectropho-tometry in Mume Flos samples at different developmental periods.The content of eight indicator components(neochlorogenicacid,chlorogenic acid,caffeic acid,rutin,hyperoside,isoquercitrin,isochlorogenic acid B and quercitrin)at different develop-mental periods was determined by UPLC,the results of the analysis showed significant differences in the content of compo-nents between the bud period(HL)and the full-opening period(QK)and that chlorogenic acid could be used as a marker收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 9基金项目：名贵中药资源可持续利用能力建设项目（2 0 6 0 30 2）；安徽道地主产药材药效物质基础研究（RZ2100000757）；安徽中医药大学人才项目(2 0 2 1rcyb011)*通信作者E-mail:文献标识码：A School of Pharmacy,Anhui University of Chinese Medicine;3 State Key Laboratory of Dao-di Herbs,Beijing 100700,China接受日期：2 0 2 3-0 7-2 4文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-1915-141916of differential quality between the different developmental periods.The results of the DPPH radical scavenging assay on theantioxidant activity of Mume Flos at different developmental periods showed that the antioxidant capacity was closely related tothe content of its components and gradually decreased with the development of flowers.The results of this paper can provideanalytical methods and data support for the dynamics of the chemical constituents and the determination of the optimum har-vesting period of Mume Flos.Key words:Mume Flos;developmental periods;flavonoids;phenylpropanoids;antioxidant activity;chlorogenic acid绿萼梅为蔷薇科植物梅Prunus mume（Si e b.）Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，作为常用中药收录于2020年版中国药典1 中,具有疏肝和中、化痰散结的功效，常用于治疗肝胃气痛、郁闷心烦、疮毒等病症。古籍记载和现代研究均认为梅花以“绿萼”人药优良2,3,其特点是花萼灰绿色、花瓣黄白色,气味清香，临床疗效较好。作为药食同源药材4,绿萼梅还可用来做茶叶、糕点等食品，且其凛冬开放,清新淡雅，被列为名花之首,具有很高的观赏价值,绿萼梅的综合应用越来越受到关注5国内外学者对梅花的化学成分和药理作用开展大量研究6.7 。以绿原酸为代表的苯丙素类成分及黄酮类成分为梅花药理活性的主要物质基础8.9,其抗氧化10 、抗血小板凝集【1、抗黑色素生成12 及抗抑郁8 等作用被广泛报道。近年来，梅花中的类黄酮因具有抗氧化、抗抑郁等作用而受到越来越多的关注13-5。绿原酸及异鼠李素、皮素、异榭皮苷、金丝桃苷、芦丁等黄酮类化合物已从梅花中分离鉴定16 。然而,关于绿萼梅中的整体化学成分组成鲜有报道,阻碍了其次生代谢产物的深人研究与开发。药用植物的次生代谢产物具有多种生物活性，是药材发挥药效的重要物质基础17 。研究发现,植物的不同生长和发育阶段是影响植物中次生代谢产物积累的重要因素18 。尤其对于花类药材来说,采收时期可显著影响其次生代谢产物的积累192 1。为研究不同发育时期绿萼梅花器官中化学成分的动态变化规律及抗氧化活性差异，首先采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱法（UPLC-QE-MS)进行定性分析,明确绿萼梅的化学组成;通过紫外-可见分光光度法对3个发育时期共18 批绿萼梅样品的总黄酮和总苯丙素含量进行测定；进一步采用超高效液相色谱法（UPLC）对绿萼梅样品中8 个指标性成分（新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异榭皮苷、异绿原酸B、皮苷）进行含量测定，比较不同发育时期中8 个成分的含量差异；采用DPPH法测定抗氧化活性，将总成分及指标性成分含量与抗氧化活性进行相关性分析。研究结果为明天然产物研究与开发确不同发育时期绿萼梅化学成分及活性的差异，确定绿萼梅药材的最佳采收期提供科学依据。1材料与方法1.1 仪器与试药Vanquish超高效液相色谱、OrbitrapExploris120高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ACQUITYH-CLASS型超高效液相色谱仪（美国Wa-ters公司）；METASHUV-8000紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）;LGJ-10真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；JXFSTPRP-24研磨仪（上海净信科技有限公司）；AB135-S型十万分之一天平（梅特勒-托利多有限公司）;AS20500BDT超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）;Heraeus Fresco17离心机（美国ThermoFisher Scientific 公司）;明澈D24 UV纯水仪（MerckMillipore)。对照品新绿原酸（批号MUST-21030108）、绿原酸（批号MUST-21070910）、咖啡酸（批号MUST-18032003）、芦丁（批号MUST-21011510）、异绿原酸B（批号MUST-21030602）、皮苷（批号MUST-17120503）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；金丝桃苷（批号DST201013-023）购自成都乐美天医药科技有限公司；异榭皮苷（批号CFN9875）购自武汉天植生物技术有限公司，质量分数均98%。抗坏血酸（批号2 0 150 6 17，国药集团化学试剂有限公司）;DPPH试剂（批号C11753367，上海麦克林生化科技股份有限公司）；甲醇和乙睛为质谱级（CNWTechnologies）；甲酸为质谱级（美国Sigma公司）；水为超纯水,其他试剂均为分析纯。1.2试验材料本研究样品采自安徽省庐江县金盆山梅花种植基地，由欧金梅教授鉴定为蔷薇科李属绿萼梅的花。根据梅花的不同发育时期，分别于2 0 2 2 年1月15日（花蕾期,HL）、2 0 2 2 年1月2 0 日（半开期，BK）、2022年1月2 5日（全开期，QK）采集新鲜样品。将不同批次绿萼梅样品真空冷冻干燥，放人干燥器中保存备用。来源信息见表1。Vol.35Vol.35吴瑞等：UPLC-QE-MS结合UPLC表征绿萼梅不同发育时期的成分差异及抗氧化活性研究Table 1Information of 18 batches of Mume Flos批次编号BatchNumberS1HL-1S2HL-2S3HL-3S4HL-4S5HL-5S6HL-6S7BK-1S8BK-2S9BK-3S10BK-4S11BK-5S12BK-6S13QK-1S14QK-2S15QK-3S16QK-4S17QK-5S18QK-61917表118 批绿萼梅样品信息发育时期Developmental period花蕾期Bud period半开期 Half-opening period全开期Full-opening period来源Source安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江安徽庐江1.3UPLC-QE-MS定性分析1.3.1供试品溶液的制备将绿萼梅样品真空冷冻干燥,用研磨仪研磨至粉末状。称取10 0 mg粉末,加入50 0 L提取液(80%甲醇)溶解，涡旋30 s,45Hz匀浆4min,冰水浴超声1h,静置后离心（12 0 0 0 r/min，4）15min,取上清液,过0.2 2 m微孔滤膜,即得。每个样本各取10 0 L混合成质控样本（qualitycontrol，QC)。1.3.2色谱条件Waters ACQUITY UPLC BEH Crs(100 mm 2.1mm,1.7m）色谱柱，流动相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈(B）,流动相梯度洗脱程序为0 11min,85%25%A;11 12 min,25%2%A;12 14min,2%A。体积流量0.5mL/min;柱温30;进样量5L。1.3.3质谱条件OrbitrapExploris120质谱仪能够在控制软件（Xc a l i b u r，T h e r m o Fi s h e r Sc i e n t i f i c）控制下基于FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：鞘气体流量：35Arb，辅助气体流量：15Arb，离子传输管温度：350，蒸发器温度：350，全MS分辨率：6 0 0 0 0,MS/MS分辨率：150 0 0,碰撞能量：16/32/48（在NCE模式下）喷雾电压：5.5kV(正离子)或4kV(负离子）。1.3.4数据处理将采集所得数据导人 Compound Discoverer 3.1软件,获取匹配和对齐的峰值数据,Excel软件将数据进行归一化后导人SIMCA-P14.1,再进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares dis-criminant analysis,OPLS-DA）。根据变量投影重要性指标(variable importance in projection,VIP)1,P0.05筛选潜在的差异代谢物。通过SPSS26.0软件进行统计学分析,采用单因素方差分析和t检验将各组数据进行统计比较,P0.05认为差异有统计学意义。1.4总黄酮及总苯丙素的含量测定1.4.1供试品溶液的制备精密称取绿萼梅样品粉末约0.5g（过四号1918筛），置具塞锥形瓶中,精密加人50%甲醇50 mL,密塞，称定重量,超声处理（2 50 W,40kHz)45min，放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀，滤过,取续滤液，即得。1.4.2总黄酮的含量测定以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-三氯化铝法2 2 ,510 nm处测定吸光值,绘制芦丁标准曲线。取2 mL供试品溶液，同法显色，由芦丁标准曲线回归方程(Y=0.011X-0.0073,r=0.9990)计算供试品溶液中总黄酮含量。绿萼梅样品中总黄酮的含量按公式(1)计算。含量=(c n V.)/(c V,103)100%式中,n：稀释倍数;Ci:供试品溶液中活性成分（总黄酮、总苯丙素）的浓度，g/mL;C：供试品溶液的浓度,mg/mL；Vi：反应体系总体积,mL;Vz：测定含量时所需供试品溶液的体积,mL。1.4.3总苯丙素的含量测定以绿原酸为对照品,参照文献测定方法2 3,330nm处测定吸光值,绘制绿原酸标准曲线。取1 mL供试品溶液,同法显色，由绿原酸标准曲线回归方程(Y=0.0516X+0.0003,r=0.9999)计算供试品溶液中总苯丙素含量。1.5UPLC定量分析指标性成分1.5.1色色谱条件色谱柱选用Waters-C18色谱柱（2.1 mm 100mm,1.7m）,流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0 6 min,10%17%A;6 12min,17%A;12 20 min,17%40%A),流速 0.2mL/min,进样量2 L，柱温30，检测波长355nm。1.5.2对照品储备液的制备准确称取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、榭皮苷对照品适量,加50%甲醇制成质量浓度分别为0.40 4、1.2 56、0.316.0.692、0.432、0.52 4、0.390.0.354m g/m L的混合对照品溶液。1.5.3供试品溶液的制备精密称取绿萼梅样品粉末约0.5g（过四号筛）,置具塞锥形瓶中,精密加人50%甲醇50 mL,密塞,称定重量,超声处理（2 50 W,40kHz)45min,放冷,再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,取续滤液，即得天然产物研究与开发1.5.4方法学验证1.5.4.1线性关系考察将混合对照品溶液用50%甲醇稀释成一系列的梯度浓度溶液后，按“1.5.1”项下条件进样分析，以待测化合物峰面积对浓度进行线性回归,得到各成分标准曲线。1.5.4.2精密度试验取混合对照品，按“1.5.1”项色谱条件重复进样6 次，记录新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷的色谱峰面积并计算 RSD值。1.5.4.3重复性试验%(1)精密称取绿萼梅（HL-1）样品粉末6 份，每份0.5g，按“1.5.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“1.5.1”项下方法分别进样测定，记录新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷的色谱峰面积,计算各成分的质量分数及其RSD值。1.5.4.4稳定性试验取同一绿萼梅供试品（HL-1）溶液,分别于配制后0,2,4,8,12,2 4h进样测定,按 1.5.1”项色谱条件重复进样6 次，记录新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷的色谱峰面积并计算RSD值。1.5.4.5力加样回收率试验精密称定已知含量的绿萼梅（HL-1）样品粉末0.05g,平行6 份,分别加入适量的新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷对照品溶液，按“1.5.3”项下方法制备样品溶液,进样分析,记录各化合物的峰面积,计算各成分的含量。1.5.5样品含量测定按照“1.5.3 项下方法制备18 批绿萼梅样品溶液,按“1.5.1 项下条件进样测定，分别测定新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异皮苷、异绿原酸B、皮苷的含量。1.6DPPH法测定不同发育时期绿萼梅的抗氧化活性1.6.11DPPH乙醇溶液的制备精密称取DPPH粉末3.94mg，置于10 0 mL量瓶中,加95%乙醇定容至刻度，摇匀，超声30 min，即得0.10 mmol/LDPPH乙醇溶液。避光，备用。Vol.35Vol.351.6.21供试品溶液的制备按照“1.5.3”项下方法制备18 批绿萼梅样品母液（10 mg/mL），加人50%甲醇依次稀释制成药材浓度分别为5.0 0、2.50、1.2 5、0.6 2 5、0.313、0.156.0.078.0.039.0.020mg/mL的待测溶液。1.6.3阳性对照溶液的制备精密称取抗坏血酸（Vc）粉末0.1g,加人50%甲醇10 mL,制得Vc母液（10 mg/mL）,加人50%甲醇依次稀释制成质量浓度分别为5.0 0、2.50、1.2 5、0.625,0.313.0.156,0.078、0.0 39,0.0 2 0 m g/m L的Vc50%甲醇溶液。避光，备用。1.6.4测定方法取0.10 mmol/L DPPH乙醇溶液3mL,置10mL具塞试管中,分别加人不同浓度的样品溶液0.5mL,摇匀,充分反应6 0 min，置紫外-可见分光光度计中,于517 nm波长处测定吸光度,按下列公式计算清除率。清除率=1-(A,-A,)/A 10 0%式中,A；为样品组的吸光度；A；为空白组的吸光度（以3mL95%乙醇与0.5mL50%甲醇溶液混合物为空白组）；A。为对照组的吸光度（以50%甲醇溶液代替样品溶液）。吴瑞等：UPLC-QE-MS结合UPLC表征绿萼梅不同发育时期的成分差异及抗氧化活性研究19192丝结果与分析2.1代谢物的统计分析分别从正负离子模式的QC样本中随机选取6个特征离子,计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviations,RSD）,对分析方法与仪器的稳定性和重复性进行评估,结果显示保留时间的RSD为0.11%0.47%，峰面积的RSD为0.96%3.2 5%，表明仪器的稳定性和重复性良好，所采集数据可用于进一步分析。共检测了32 8 种代谢物,包括6 7 种黄酮类化合物、50 种苯丙素类化合物、10 4种类化合物、2 6 种酚类化合物、2 4种生物碱、11种有机酸及其衍生物、8 种氨基酸衍生物及其他38 种代谢物（见图1A）。绿原酸及某些黄酮类物质（如金丝桃苷、异皮苷）是评价梅花是否达到中药材标准最基本指标,且在所鉴定的代谢物中，类黄酮含量较高,因此对检测到的类黄酮代谢物的类型进行归类分析。在6 7 种黄酮类化合物中,共有(2)黄酮醇2 7 种,黄酮19 种，二氢黄酮12 种,异黄酮4种,二氢查尔酮3种,黄烷醇1种,花色素1种（见图1B）。为了进一步分析不同发育时期梅花黄酮类成分与苯丙素类成分的含量变化，通过半定量方法对其进行相对含量测定(见图1C）。由图可明显看出APhenylpropanoids其他Others酚类Phenols生物城Alkaloid有机酸及其衍生物Organic acids andderivatives舞华酸衍生物Aminoacidderivatives0C11.0蓝类Terpenoids,黄酬类Flavonoids苯丙素类104B黄酮醇Flavonois67黄酬Flavonoids50二氢黄酮Flavanones38异黄酮Isoflavones26二氢查尔酬24Dihydrochalcones黄烷醇11Flavanols8花色素Anthocyanidins12040代谢物数量Numberofmetabolites2719126080100-芦TRutin一异皮苷Isoquercitrin一金丝桃Hyperoside01.0-5代谢物数量Numberofmetabolites*1015*2025300.50.0HLBKQKHLBKQKHLBKQK图1不同发育时期绿萼梅代谢物数量统计（A）、黄酮类化合物分类(B)及相对含量变化(C)Fig.1 Quantitative statistics of metabolites(A),classification of flavonoids(B)and changesin relative content(C)of Mume Flos at different developmental periods0.5-0.0注：*P0.05;*P0.01;*P0.0001。HLBKQK1920各类成分的变化趋势,以绿原酸为代表的苯丙素类成分及黄酮类成分的含量在3个发育时期中均呈下降趋势。利用GraphPad Prism8对图1C中4种成分进行单因素方差分析,结果表明4种成分在花蕾期与半开期、花蕾期与全开期两个比较组中均具有显著性差异,除金丝桃苷外,其余3种成分差异极其显著(P0.000 1)。2.2总成分的含量测定不同发育时期绿萼梅总黄酮的含量变化情况见A20-(%)15-10-5-0图2不同发育时期绿萼梅总黄酮（A）及总苯丙素（B）的含量差异分析Fig.2 Difference analysis of the total flavonoid(A)and phenylpropanoid(B)content of Mume Flos in different developmental periods注：*P0.05;*P0.01;*P0.0001。2.3指标性成分的含量测定2.3.1方法学验证2.3.1.1线性关系考察Table 2 Linear equation,correlation coefficient and linaer range of reference substance对照品Reference substance新绿原酸Neochlorogenic acid绿原酸Chlorogenic acid咖啡酸Cafficacid芦丁Rutin金丝桃苷Hyperoside异榭皮苷 Isoquercitrin异绿原酸 B Isochlorogenic acid B皮苷Quercitrin天然产物研究与开发图2 A,总黄酮含量以花蕾期最高,随着绿萼梅的生长,其花器官中总黄酮含量逐渐降低。由图可知,总黄酮的含量在三个发育时期中均具有显著性差异，其中花蕾期与半开期及全开期之间差异极其显著（P 1为提取标准,可提取出两个主成分，累计方差贡献率达96.7 12%，能24图4绿萼梅样品A)及混合对照品(B)色谱图6810时间Time(min)基本反映出样本的主要信息。主成分分析得分图见图5,由得分图可知,不同发育时期绿萼梅样品分别集中于相应区域，提示不同发育时期绿萼梅样品在化学成分的量上存在一些差异性。在主成分分析提取到的两个主成分的基础上，建立监督模式偏最小二乘判别分析模型,进一步寻找不同发育时期绿萼梅的差异标志物。正交偏最小二乘判别分析得分图1214161820222426HL1924见图6,18 批绿萼梅样品被分为3组，与主成分分析结果一致,说明不同发育时期绿萼梅化学成分的含量存在一定差异。变量重要性投影值(VIP)图见图7,筛选出贡献率较大的1个变量（VIP1）为绿原酸,说明不同发育时期绿萼梅的化学成分差异是由BK21.5BK31OBK10.5BK5QK6BK40QK2BK6HL6HL3OHL5-0.5QK4QR1QK3-1-1.5-2-2.5-8R2X1-0.829图518批绿萼梅样品主成分分析得分图Fig.5The PCA score plot of 18 batches of Mume Flos8006004002000-200-400-600-800-1000-4000-3000-2000-1000R2X1=0.921R2X2=0.0563图618批绿萼梅样品OPLS-DA得分分布图Fig.6The OPLS-DA score plot of 18 batches of Mume Flos天然产物研究与开发该成分引起的,绿原酸可以作为不同发育时期绿萼梅之间的差异标志物。进一步分析与比较不同发育时期绿萼梅样品中黄酮类和苯丙素类成分含量变化及差异性，利用GraphPadPrism8对8 种指标性成分进行单因素方HL2BKQKOHL4OHL2OHL1-6-4R2X2-0.108QK6BK5HL3BK6BK4QK2QK4QK3QK1QK50100020003000Ellipse:HotellingsT2(95%)Vol.35-20BK3BK2BK1HL4HL5HL6HL2HL12Ellipse:HotellingsT2(95%)46BKQK2.01.51.00.50Var-2Fig.7VIP value from OPLS-DA load diagram of 18 batches of Mume FlosVar-4图7 18 批绿萼梅样品OPLS-DA的VIP图Var-6Var-5VarID(Primary)Var-1Var-7Var-8Var-3Vol.35差分析,见图8。花蕾期和全开期中8 种成分均具有显著性差异,值得注意的是,除金丝桃苷和异绿原酸B之外,其余6 种成分差异极显著（P0.001）。对于花蕾期与半开期,除金丝桃苷和异绿原酸B之外,其余6 种成分均具有显著性差异。咖啡酸和金AC*0.5-*30.4-0.3-0.2-含0.10.0E0.8-(%)0.6-0.4-0.2-0.0Fig.8 Difference analysis of the content of flavonoids and phenylpropanoids in different developmental periods of Mume Flos注：A.新绿原酸;B.绿原酸；C.咖啡酸；D.芦丁;E.金丝桃苷；F.异榭皮苷；G.异绿原酸B;H.榭皮苷；*P0.05；*P 0.0 1；*P0.001;*P0.000 1。No t e:A.Ne o c h l o r o g e n i c a c i d;B.Ch l o r o g e n i c a c i d;C.Ca f f i c a c i d;D.Ru t i n;E.H y p e r o s i d e;F.Is o q u e r c i t r i n;2.4不同发育时期绿萼梅的抗氧化活性不同发育时期绿萼梅样品的DPPH清除率见图9,各发育时期的抗氧化活性呈浓度依赖性，随着浓度的增大,绿萼梅各时期样品对DPPH自由基的清除能力随之增强。将计算结果导人 SPSS 26.0计算自由基清除率的半最大效应浓度（ECso）,结果表明抗坏血酸的ECso为0.0 2 0 mg/mL,与文献报道ECso值接近2 4。各样品抗氧化活性ECso见表5。将各吴瑞等：UPLC-QE-MS结合UPLC表征绿萼梅不同发育时期的成分差异及抗氧化活性研究B8(%）u o 0 鲁号642一0HLBKHBKG.Isochlorogenic acid B;H.Quercitrin;*P0.05*P0.01*P0.001;*P0.000 1.1925丝桃苷在半开期与全开期之间无差异性，其余成分均具有显著性差异,其中芦丁差异极显著。可以看出,花蕾期与全开期之间具有显著的差异性,成分含量差异较大,与总黄酮和总苯丙素的含量变化趋势一致,提示绿萼梅药材应该在开花以前采收。*冰*D0.15-1.5-(%)(%)*0.05含0.00QKHBKF*0.8(%)0.6-0.40.20.0QK图8 不同发育时期绿萼梅黄酮类和苯丙素类成分的含量差异分析1007550*0.0QKHBKG0.6-(%)0.4-0.20.0HLBKQK*QKHLH0.20-(%）0.15-0.10-0.050.00HBKQK发育时期ECso进行单因素方差分析，比较各时期抗氧化差异,结果表明不同发育时期中全开期的抗氧化活性最低，与总成分及指标性成分含量测定结果一致。三个发育时期之间的抗氧化活性具有显著性差异,其中花蕾期与全开期的抗氧化活性差异极显著(P0.001)。将18 批样品抗氧化活性ECso值、总黄酮、总苯丙素及8 个指标性成分的含量导人TBtools软件进VcHLBKQKBK*HBKQKQK2500图9不同质量浓度样品与抗坏血酸对DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging of DPPH free radicals by samples of different mass concentrations and vitamin C1浓度Concentration（mg/mL)23451926天然产物研究与开发Vol.35表5绿萼梅不同发育时期DPPH自由基清除能力的ECso（s,n=3)Table 5ECso value of different developmental periods of Mume Flos on DPPH radical scavenging capacity(x s,n=3)发育时期Developmental period花蕾期Bud period半开期Half-opening period全开期Full-opening period注：不同字母表示差异显著（P0.05）。Note:Different letters indicate significant differences(P0.05).行Pearson相关性分析，结果见图10。由图可知，DPPH 自由基清除率ECso值与总黄酮、总苯丙素及8个指标性成分存在明显的负相关（P0.05）,相关系数分别为-0.6 9、-0.8 1、-0.6 6、0.8 0、-0.6 2、-0.8 2、0.830.941.000.880.980.890.88 0.880.920.980.87 0.890.920.930.830.860.840.820.710.500.590270.460.150.640.740.820.64 0.740.550.900.880.50 0.470420.360.270.760.730.750.830.830.860.800.720.970.55 0.830.76-0.69-0.81-0.66-0.800.62-0.82-0.75-0.88-0.56-0.771.00KABCDEFGH1图10绿萼梅主要成分与抗氧化活性相关性Fig.10Correlation between the main components and antioxidant activity of Mume Flos注：A.总黄酮;B.总苯丙素;C.新绿原酸;D.绿原酸;E.咖啡酸;F.芦丁;G.金丝桃苷;H.异皮苷;I.异绿原酸B;J.皮苷;K.DPPHECso Note:A.Total flavonoids;B.Total phenylpropanoids;C.Neochlorogenic acid;D.Chlorogenic acid;E.Caffic acid;F.Rutin;G.Hyperoside;样品SampleHL-1HL-2HL-3HL-4HL-5HL-6BK-1BK-2BK-3BK-4BK-5BK-6QK-1QK-2QK-3QK4QK-5QK-6-0.75、-0.8 8、-0.56、-0.7 7。结果表明,绿萼梅中总黄酮、总苯丙素及8 个指标性成分可作为评价其抗氧化活性的指标。1.201.000.94H.Isoquercitrin;I.Isochlorogenic acid B;J.Quercitrin;K.DPPH ECso.ECs50(mg/mL)0.301 0.0040.186 0.0040.225 0.0020.272 0.0040.201 0.0010.215 0.0030.380 0.0010.264 0.0040.275 0.0010.241 0.005 0.323 0.0040.327 0.0020.356 0.0010.355 0.0030.335 0.0030.336 0.0020.388 0.0030.391 0.0020.880.920.870.861.000.91 0.920.840.270.640.420.86-0.66C0.911.000.931.000.716.250.55:0.270.72-0.62E1.000.64快.900.760.97-0.82F1.000.881.000.750.8