不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响.pdf

宁夏农林科技，Ningxia Journal of Agri.and Fores.Sci.&Tech.2023，64（07）：26-30基金项目：宁夏重点研发计划项目（2021BEF02004）、宁夏自然科学基金优秀青年项目（2022AAC05046）、宁夏自然科学基金项目（2020AAC03286）、中央财政林业改革发展资金项目“林木良种培育”。作者简介：梁晓婕（1991），女，宁夏银川人，助理研究员，研究方向为枸杞栽培及育种。*通信作者：李越鲲（1978），女，宁夏盐池人，副研究员，研究方向为枸杞品质及化学成分分析。收稿日期：2022-07-29不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响梁晓婕，李越鲲*，秦小雅，安 巍宁夏农林科学院枸杞科学研究所，宁夏 银川750002摘要：【目的】研究枸杞植株叶片及根系中氮代谢相关酶活性对施氮量的生理响应。【方法】共设置 3 种不同氮肥施用量处理，分别为 N1（减氮 20%，540 kg/hm2）、N2（中氮，675 kg/hm2）、N3（增氮 20%，810 kg/hm2），分别测定叶片和根系的硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、脲酶（UE）的活性。【结果】随着施氮量的增加，宁杞 7号叶片中 NR、GS 和 UE 的活性均呈先增加后降低的变化趋势，但 N2 处理 NR 显著高于 N1、N3（P0.05），GS 和 UE 在各处理间差异不显著（P0.05）。不同土层枸杞植株根系氮素代谢相关酶活性随施氮量的变化趋势有所不同，在 010 cm 土层中，根系的 NR、GS 及 UE 分别呈降低、先增加后降低及基本不变的趋势；在 1020 cm 土层中，根系的 NR 和 UE 均呈先增加后降低的趋势、GS 则呈先降低后基本持平的趋势；在 2030 cm土层中，根系的 NR、GS 及 UE 则分别呈先增加后降低、降低及增加的趋势；且不同施氮量间根系中 NR 活性差异显著（P0.05），各处理间 GS、UE 差异不显著（P0.05）。【结论】枸杞主栽品种宁杞 7 号叶片及根系的NR 活性对施氮量的敏感性较强，GS 及 UE 活性对施氮量反应不敏感。因此 NR 是宁杞 7 号氮代谢的关键酶，可以用来筛选最佳氮肥施用量，提高枸杞植株氮素利用效率。综合叶片与根系中 3 种不同氮代谢相关酶活性及其在不同施氮量下的变化趋势可以看出，N2（中氮，675 kg/hm2）处理更有利于酶活性的增强。关键词：枸杞；施氮量；叶片；根系；氮素代谢；酶活性中图分类号：S567.1+9文献标识码：A文章编号：1002-204X（2023）07-0026-05doi:10.3969/j.issn.1002-204x.2023.07.008Effect of Different Nitrogen Application Rates on the Activities of EnzymesRelated to Nitrogen Metabolism in Leaves and Roots of WolfberryLiang Xiaojie,Li Yuekun*,Qin Xiaoya,An Wei(Institute of Wolfberry Science,Ningxia Academy of Agriculture and Forestry,Yinchuan,Ningxia 750002)AbstractObjective The four-year-old plant of the main cultivar of wolfberry Ningqi No.7 was used as thetest material,and the physiological response of nitrogen metabolism-related enzyme activities in leaves and rootsof wolfberry plants to nitrogen application was studied by field experiment.Method Three different nitrogenfertilizer application rates were set in the experiment,namely N1(20%nitrogen reduction,540 kg hm-2),N2(medium nitrogen,675 kg hm-2),and N3(20%nitrogen increase,810 kg hm-2),and the activities of nitratereductase(NR),glutamine synthase(GS)and urease(UE)were measured in leaves and roots respectively.ResultWith the increase of nitrogen application rate,the activities of NR,GS and UE in leaves of Ningqi No.7 allshowed a trend of increasing first and then decreasing,but NR under N2 treatment was significantly higher thanthat of N1 and N3(P0.05),GS and UE had no significant difference between treatments(P0.05).In terms of 林业与草业 2664 卷 07 期root system,the change trend of root nitrogen metabolism-related enzyme activities with nitrogen application ratewas different in different soil depths.In the soil depth of 010 cm,the root NR,GS and UE showed a trendof decreasing,first increasing and then decreasing,and basically unchanged;In the soil depth of 1020 cm,root NR and UE both increased first and then decreased,while GS decreased first and then remained basicallythe same;In the soil depth of 2030 cm,the root NR,GS and UE showed a trend of increasing first and thendecreasing,decreasing and increasing respectively;In the root system,only NR activity was significantlydifferent among different nitrogen application rates(P0.05),while GS and UE had no significant differenceamong treatments(P0.05).Conclusion The NR activity of leaves and roots of the main wolfberry cultivarNingqi No.7 is more sensitive to nitrogen application rate,while GS and UE activities are not sensitive tonitrogen application rate.Therefore,NR is the key enzyme of nitrogen metabolism in Ningqi No.7,which canbe used to screen the best nitrogen fertilizer application rate and improve the nitrogen use efficiency ofwolfberry plants;In this paper,it can be seen from the comprehensive analysis of three different nitrogenmetabolism-related enzyme activities in leaves and roots and their changing trends under different nitrogenapplication rates that N2(medium nitrogen,675 kg hm-2)treatment is more beneficial to the enhancement ofenzyme activities.Key words Wolfberry;Nitrogen fertilizer application;Leaf;Root system;Nitrogen metabolism;Enzyme activity枸杞作为宁夏特色优势经济作物，生态适应性极强，抗旱、耐盐碱、耐瘠薄，具有显著的经济效益和社会效益1。枸杞植株具有良好的生态适应特性，加之“不与粮食作物争地”等政策的实施，近年来宁夏枸杞主要以盐碱地、沙荒地作为种植区域，这些区域土壤中营养匮乏、水资源供给不足，高 pH 值还对营养元素的迁移及有效供应产生了一定的抑制作用2。氮肥对各种生境条件下枸杞植株果实产量的提高及品质的改善均具有显著效果，但枸杞种植农户及企业为追求高产，盲目地采用大水大肥的粗放式管理方法，导致生产成本增加，也造成一定程度的环境污染3-5。研究不同施氮量条件下枸杞植株叶片及根系的氮代谢作用机理，对于筛选出枸杞植株最佳氮肥施用量具有重要意义，而目前关于氮肥施用量对枸杞植株氮代谢方面的研究尚少。为此，本试验选用宁夏枸杞主栽品种宁杞 7 号 4 年生植株为试材，研究施用不同水平的氮肥对叶片、根系氮素代谢相关酶活性的影响，分析不同处理下枸杞植株氮代谢的差异，为氮肥高效合理使用提供理论依据。1材料与方法1.1试验地点本试验于 2020 年 4 月起在宁夏中卫市海原县三河镇杞缘绿丰农林科技有限公司基地进行。试验地地形平坦、土层深厚、土质较好且肥力均匀，耕层土壤（020cm）的基本理化性状：pH 值为 7.82，全盐含量为 3.02g/kg，有机质含量为 9.76 g/kg，全氮含量为 1.25 g/kg，全磷含量为 0.54 g/kg，全钾含量为 11.4 g/kg，速效氮含量为 51.6 mg/kg，速效磷含量为 4.7 mg/kg，速效钾含量为 118 mg/kg。1.2试验设计供试枸杞为主栽品种宁杞 7 号 4 年生植株，所选试验材料生长旺盛、无病虫害。试验采用单因素随机区组设计，共设 3 个处理，分别为处理：N1（低肥），减氮 20%，即施纯氮 540kg hm-2；处理：N2（中肥），中氮，即施纯氮 675kg hm-2；处理：N3（高肥），增氮 20%，即施纯氮 810kg hm-2。每个处理设 3 次重复，随机区组排列。氮肥为普通尿素（含 N46%），磷肥为重过磷酸钙（含 P2O550%），钾肥为硫酸钾（含 K2O 50%），各处理磷、钾肥施用量分别为 450kg hm-2和 300kg hm-2。根据枸杞物候期进行施肥，全年共施肥 5 次，氮、磷、钾肥均分批次施入，施肥时间分别为 4 月 20 日左右（春梢生长期）、5 月 20日左右（青果期）、6 月 15 日左右（果熟期）、7 月底至8 月初（秋果期）和 9 月底（秋季休眠期）。其中：5 月 20日前氮肥施用量占全生育期的 50%以上，磷、钾肥施用量占全生育期的 40%以下；6 月以后氮肥施用量占全生育期的 50%以下，磷、钾肥施用量占全生育期的 60%以上。小区面积为 54m2（6 m9m）。田间水分管理采用当地农民传统的灌水方法，通常在施肥后的 12 d 灌水，或视土壤干湿状况而定，全生育期内共灌水 9 次左右。1.3样品采集及项目测定于 2021 年 9 月 10 日采集不同施氮量处理下的枸杞植株叶片及根系。采集叶片时每个处理随机选择5 株枸杞树作为 5 个重复，采集时在每株枸杞树冠中部不同方位选取 810 个结果枝，采集每个结果枝的中部叶 810 片，采集的叶片放入已编号的自封袋中，梁晓婕，等不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响2764 卷 07 期梁晓婕，等不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响立即置于装有干冰的恒温箱中保存。根系取样时选择与叶片取样一致的 5 株枸杞树作为 5 个重复，每株枸杞树均采集 010 cm、1020 cm 及 2030 cm 3 个土层的根系，用清水冲洗后用吸水纸擦干，放入已编号的自封袋中，同样置于装有干冰的恒温箱中保存。叶片及根系样品采集完成后均送至苏州科铭生物技术有限公司实验室测定硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、脲酶（UE）活性。其中硝酸还原酶（NR）采用微量法测定，测定原理是硝酸还原酶（NR）催 化硝酸 盐还原 为亚硝 酸盐，NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2O；NADH 在 340 nm 有最大吸收峰，通过测定 NADH 减少速率来表示 NR 活性；谷氨酰胺合成酶（GS）同样采用微量法进行测定，测定原理是谷氨酰胺合成酶（GS）在 ATP 和 Mg2+作用下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，谷氨酰胺进一步转化为-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成的络合物在 540 nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定；脲酶（UE）也采用微量法进行测定，测定原理是利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的 NH3-N。1.4数据分析采用 EXCEL 2007 软件整理数据，采用 SPSS23.0 软件对试验数据进行方差分析及相关性分析。2结果与分析2.1不同施氮量枸杞叶片氮素代谢相关酶活性差异性分析如表 1 所示，不同施氮量枸杞植株叶片中的氮素代谢相关酶活性不同。N2 处理枸杞叶片中的硝酸还原酶的活性最高，为 432.56 nmol/min/g 鲜重，显著高于 N1、N3（P0.05）；N1、N3 处理间枸杞叶片中的硝酸还原酶活性差异不显著（P0.05）。各处理间枸杞叶片中的谷氨酰胺合成酶与脲酶差异均不显著（P0.05）；其中：谷氨酰胺合成酶在枸杞叶片中的活性由大到小依次为 N2、N1、N3，脲酶在枸杞叶片中的活性由大到小依次为 N2、N1、N3。2.2不同施氮量枸杞根系氮素代谢相关酶活性差异性分析如表 2 所示，不同施氮量条件下枸杞植株根系中的硝酸还原酶活性在不同土层深度中均具有差异。在010 cm 土层中，3 个处理间枸杞根系硝酸还原酶活性差异显著（P0.05），其活性由大到小依次为N1、N2、N3；在 1020 cm 土层中，N1、N2 处理间根系硝酸还原酶活性差异不显著（P0.05），但均显著高于 N3 处理（P0.05），其活性由大到小依次为 N2、N1、N3；在2030 cm 土层中，N1、N2 处理间根系硝酸还原酶活性差异显著（P0.05），但与 N3 处理间差异均不显著（P0.05），其活性由大到小依次为 N2、N3、N1。整体上看，N1、N2 处理枸杞植株根系硝酸还原酶活性较高。如表 3 所示，不同施氮量枸杞植株根系中的谷氨酰胺合成酶活性在不同土层深度中均无显著差异（P0.05）。在 010 cm 土层中，枸杞植株根系中谷氨酰胺合成酶活性由大到小依次为 N2、N3、N1；在 1020 cm 土层中，根系中的谷氨酰胺合成酶活性由大到小依次为 N1、N3、N2；在 2030 cm 土层中，根系中谷氨酰胺合成酶活性由大到小分别依次为 N1、N2、N3。整体上看，N1、N2 处理枸杞植株根系谷氨酰胺合成酶活性同样较高。如表 4 所示，不同施氮量枸杞植株根系中的脲酶活性在不同土层深度中差异不显著（P0.05）。在 010 cm 土层中，根系中的脲酶活性由大到小依次为N2、N1、N3；在 1020 cm 土层中，根系中的脲酶活性由大到小依次为 N2、N3、N1；在 2030 cm 土层中，根系中的脲酶活性由大到小依次为 N3、N2、N1。整体上看，N2、N3 处理枸杞植株根系脲酶活性较高。表 1不同施氮量下枸杞叶片氮素代谢相关酶活性差异性分析处理硝酸还原酶（NR）/nmol （min g）-1鲜重谷氨酰胺合成酶（GS）/mol （h g）-1鲜重脲酶（UE）/g （min g）-1鲜重N1297.2838.68b4.040.53a0.800.07aN2432.5648.82a4.160.45a0.900.11aN3256.3136.42b3.820.47a0.770.08a注：表中同列数据肩标小写字母不同，表示差异显著（P0.05）。下表同。表 2不同施氮量枸杞根系硝酸还原酶（NR）活性差异性分析单位：nmol （min g）-1鲜重处理土层深度010 cm1020 cm2030 cmN1435.3822.46a219.7130.57a180.1424.92bN2228.4020.90b249.2531.12a266.4321.36aN3151.4420.36c138.1617.30b227.4418.89ab表 3不同施氮量下枸杞根系谷氨酰胺合成酶（GS）活性差异性分析单位：mol （h g）-1鲜重处理土层深度010 cm1020 cm2030 cmN12.070.29a2.320.21a2.530.37aN22.290.07a2.070.09a2.250.26aN32.180.11a2.100.05a2.110.22a2864 卷 07 期梁晓婕，等不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响2.3不同施氮量枸杞根系及叶片中氮素代谢相关酶活性相关性分析如表 5 所示，对枸杞叶片及根系的硝酸还原酶活性（NR）、谷氨酰胺合成酶活性（GS）以及脲酶活性（UE）两两进行皮尔逊双变量相关性分析发现，仅叶片硝酸还原酶活性与叶片脲酶活性之间具有显著相关性（r=0.959，P0.05），其他指标间均不具有显著相关性（P0.05）。3讨论氮素是植物代谢过程所需要的重要营养元素之一，植物吸收的氮主要分为有机氮化物和无机态氮两类。植物不能直接将空气中的氮气转化为自身利用，它们一般吸收利用土壤或者环境中的 NO3-或者NH4+，并在相关酶的作用下合成谷氨酰胺和谷氨酸，然后经过转氮作用形成不同的氨基酸，再合成蛋白质6。氮代谢过程包括氮素同化、积累和蛋白质合成等过程，在氮素同化过程中，硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）酶活性直接影响着植物氮代谢的过程，与植物的生长发育、果实产量和品质的形成均具有密切相关性7。其中硝酸还原酶是植物体内硝态氮同化的第一个酶，也是整个硝态氮代谢的关键酶、限速酶8，前人在棉花9、水稻10、早熟禾11等农作物上的研究结果均表明，高活性的硝酸还原酶对于植物的生长发育及产量的形成具有促进作用。本研究结果表明，随着施氮量的增加，枸杞主栽品种宁杞 7 号叶片中的硝酸还原酶活性呈先增加后降低的趋势；在 010 cm 土层中，枸杞植株根系中的硝酸还原酶活性呈降低趋势，在1020 cm、2030 cm 土层中，硝酸还原酶活性呈先增加后降低的趋势，且各处理间差异显著（P0.05）。说明提高土壤施氮量可以使枸杞植株硝酸还原酶活性提高，但是其用量过高则会对硝酸还原酶活性产生抑制作用，进而影响到枸杞植株的生长发育、果实产量与品质的形成。谷氨酰胺合成酶（GS）与谷氨酸合成酶（GOGAT）循环是高等植物氨同化的主要途径，在无机氮转化为有机氮的过程中起到关键作用，其活性受到植株生长年限、植物种类、氮素形态及浓度等诸多因素的影响12。张智猛的研究结果表明，随着施氮量的增加，玉米13、花生14中的谷氨酰胺合成酶活性会随之先升高后降低；但也有研究表明，随着施氮水平的提高小麦中的谷氨酰胺合成酶活性随之提高15。在本研究中，枸杞主栽品种宁杞 7 号叶片中的谷氨酰胺合成酶活性随施氮量的增加呈先升高后降低的趋势；在 010 cm土层，枸杞植株根系中的谷氨酰胺合成酶活性呈先增加后降低的趋势，在 1020 cm、2030 cm 土层中呈降低的趋势；各处理间谷氨酰胺合成酶活性差异不显著（P0.05）。同样说明高氮浓度条件会抑制枸杞植株中的谷氨酰胺合成酶活性，但抑制效果不明显。土壤中的尿素能否被植物迅速地利用，取决于植物内外环境中存在的脲酶（UE）活性。在植物细胞中，已知能分解尿素的酶有 2 类：脲酶（或尿素酰胺水解酶）和尿素酰胺酶。二者均在细胞质中将尿素水解为CO2和 NH3，NH3/NH4+随即被谷氨酸合成酶利用，以供其他含氮大分子（蛋白质及核酸等）的生物合成16。在前人的研究结果中，多针对土壤中脲酶的活性进行研究，对植物体内脲酶活性的研究较少。如，李生仪等17的研究结果表明，施氮始终能增加根际土壤脲酶活性，对苜蓿的生长有良好的促进作用，并减轻了土壤氮限制，从而增加微生物数量改善了根系的发育和分泌;秦宇坤等18在尿素施用量对棉田土壤脲酶活性的研究结果表明，土壤脲酶活性随施氮量的增加而增强，但当施氮量超过 240 kg/hm2时，土壤脲酶活性降低，且随着土层深度增加，脲酶活性也呈现下降趋势。本文针对枸杞植株叶片及根系中脲酶活性随施氮量表 4不同施氮量下枸杞根系脲酶（UE）活性差异性分析单位：g （min g）-1鲜重处理土层深度010 cm1020 cm2030 cmN10.740.01a0.720.07ab0.730.10aN20.750.03a0.810.05a0.790.03aN30.710.07a0.750.03ab0.830.08a表 5根系及叶片中氮素代谢相关酶活性相关性分析相关系数 叶片 NR 叶片 GS 叶片 UE 根系 NR 根系 GS 根系 UE叶片 NR10.7870.959*0.2620.0270.618叶片 GS10.9100.1620.1800.751叶片 UE10.112-0.0320.784根系 NR10.918-0.503根系 GS1-0.509根系 UE1注：采用皮尔逊双变量相关性分析，数据肩标*代表显著相关性（P0.05）。2964 卷 07 期梁晓婕，等不同施氮量对枸杞叶片及根系氮素代谢相关酶活性的影响的变化规律进行研究，发现叶片中脲酶活性随着施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势，在 010cm、1020 cm 以及 2030 cm 土层的根系中分别呈基本不变、先增加后降低以及增加的趋势，但各处理间差异不显著（P0.05）。说明随着土壤中氮浓度的增加，会影响枸杞植株叶片及根系中脲酶的活性，但影响效果不明显。4结论枸杞主栽品种宁杞 7 号叶片及根系的硝酸还原酶活性对施氮量的敏感性较强，可以用来筛选最佳氮肥施用量，以提高枸杞植株氮素利用效率。综合枸杞植株叶片与根系中 3 种不同氮代谢相关酶活性及其在不同施氮量下的变化趋势可以看出，N2（中氮，675 kg hm-2）处理更有利于枸杞主栽品种宁杞 7 号植株叶片及根系中氮代谢相关酶活性的增强。参考文献：1 尹志荣，黄建成，桂林国，等.不同滴灌量枸杞田间土壤水分运移特征J.西北农业学报，2020，29（11）：1695-1702.2 周喜荣，张丽萍，蒋鹏，等.宁夏枸杞生育期干物质与氮磷钾积累动态和养分需求规律J.中国土壤与肥料，2021（1）：262-272.3 李钰，何文寿，张学军，等.枸杞土壤肥力与合理施肥技术研究进展J.农业科学研究，2006（2）：62-65.4 韩梦雪，张林.施肥方式和施氮量对枸杞微孔陶瓷根灌土壤水氮分布的影响J.节水灌溉，2021（1）：60-64.5 田永雷，张玉霞，朱爱民，等.施氮对科尔沁沙地饲用燕麦产量及氮肥利用率的影响J.草原与草坪，2018，38（5）：54-58.6 徐洪超，商靖，刘铭荟，等.氮代谢相关酶的研究进展J.安徽农业科学，2022，50（4）：17-20.7 王鑫，张玉霞，鲍青龙，等.施氮量对不同饲用燕麦品种苗期氮代谢相关酶活性的影响 J.内蒙古民族大学学报（自然科学版），2020，35（5）：396-401.8 孙宝启，李玉京.硝酸还原酶与氮素利用的关系及其在作物遗传育种中的应用（综述）J.北京农业大学学报，1993（3）：29-33.9 王雷山，AZIZ K，宋兴虎，等.棉花主茎叶与根系硝酸还原酶活性分布对播期和密度的响应J.棉花学报，2017，29（1）：88-98.10 杨忠良，刘海英，刘会，等.氮素对水稻幼苗氮代谢相关酶活性及相关基因表达的影响J.黑龙江农业科学，2017（10）：26-31.11 张浩玮，白小明，陈辉，等.草地早熟禾（Poa pratensis）N 积累、分配和硝酸还原酶活性对氮、磷肥的响应J.中国沙漠，2019，39（5）：222-231.12 黄勤妮，印莉萍，柴晓清，等.不同氮源对小麦幼苗谷氨酰胺合成酶的影响J.植物学报，1995（11）：856-862.13 张智猛，戴良香，胡昌浩，等.氮素对不同类型玉米蛋白质及其组分和相关酶活性的影响J.植物营养与肥料学报，2005（3）：320-326.14 张智猛，万书波，宁堂原，等.氮素水平对花生氮素代谢及相关酶活性的影响J.植物生态学报，2008（6）：1407-1416.15 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