In vitro pull down.doc

Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。Pull-Down实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。
Pull-Down vs.免疫沉淀
Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用诱饵蛋白代替了抗体。在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。
诱饵蛋白固相化策略
1.依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如‘bait the hook’）。如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的标签，以适用于现成的亲和树脂。即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。
2. 如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体。接下来的试剂盒被优化用于这些特别的亲和系统。列于下面几页中的Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒，使用含有GST标签的特异GTPase蛋白的下游效应子进行检测。
一、生物素标记Pull-Down实验
实验者须提供生物素化蛋白作为“诱饵”和表达互作靶标推测蛋白 （“猎物”）的细胞。亲和体系是已知且特异的生物素-链亲和素的相互作用。生物素化蛋白作为“诱饵”捕获推测的连接配体（即“猎物”）。在一个典型的pull-down实验中，被固定的诱饵蛋白在细胞裂解液中孵育。经过指定步骤的漂洗后，“反应物”被选择性洗脱以进行凝胶分析或Western印迹。因为生物素-链亲素和的互作连接亲和度较高，一般情况下猎物蛋白被洗脱掉，而生物素化诱饵蛋白则仍保持固定在链亲和素琼脂糖树脂上，不被洗脱。链亲和素琼脂糖树脂

二、GST Pull-Down实验
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

三、多组氨酸 Pull-Down实验
用于捕获及纯化与多组氨酸标签融合蛋白发生相互作用的蛋白。实验者需提供含有标签的融合蛋白（诱饵）及表达推测蛋白相互作用靶蛋白（猎物）的细胞.

四、活化的GTPase Pull-Down
每个小GTPase各自的下游效应器的结合结构域均以GST融合蛋白的形式表达，当其固相化于树脂之上，可用于pulldown（例如，亲和纯化）活化的或结合GTP的GTPase。例如，Raf1的GST-RBD（Ras结合结构域）可以pull down活化的Ras。通过Western Blot对被pull down的活化的GTPase进行检测。

使用各自的Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒检测活化的Ras，Cdc42，Rac1，Rho和Rap1。使用GTPγS或GDP处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST融合蛋白及固定化的谷胱甘肽孵育。一半洗脱下来的pulldown样品（25μl）和20μg裂解液通过Western blotting进行分析，分别使用抗-Rac1，抗-Cdc42，抗-Pan-Ras，抗-Rho或抗-Rap1抗体。GDP导致的失活证实了活化的GTPase检测的特异性。

Thermo Scientific活化的GTPase Pull-Down和检测试剂盒与供应商U试剂盒的性能比较。使用各自的试剂盒对GTPγS或GDP处理的NIH3T3细胞裂解液（500μg）进行Rac1，Cdc42，Ras，Rho和Rap1的亲和沉淀。一半洗脱的pull-down样品（25μl）用Western blot进行分析。根据厂商说明书的指导进行分析。

Thermo Scientific活化的Rac1 Pull-Down和检测试剂盒的灵敏度。不同量的GTPγS处理的NIH 3T3细胞裂解液与GST-Pak1-PBD及固定化的谷胱甘肽孵育。GDP处理的细胞裂解液（500μg）与GST-Pak1-PBD及固定化的谷胱甘肽孵育作为阴性对照。使用试剂盒中提供的抗-Rac1的小鼠单克隆抗体，对一半的洗脱的pull-down样品（25μl）和20μg裂解液通过Western blotting进行分析。
1. 先分离膜，然后提取2.用特殊的去污剂选择性分离
   1．热变性及酸碱变性沉淀法 用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。
2．有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。
3．等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。
4．非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子。
5．生成盐复合物沉淀 用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。
6．盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
第一节 盐析法
一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。
盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。
一．影响盐析的若干因素1．蛋白质浓度
高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。
2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 
离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。 但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。
4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。
二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
　　硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。
　　使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
第二节 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
　　有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、