DGGE+操作指南.doc

DGGE 操作指南
第一部分：操作前准备
试剂准备
1. 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存液

2．50xTAE缓冲液

高压灭菌20-30min
3.变性剂

脱气10-15min，过0.45μ膜。4℃棕色瓶中保存。100%变性剂储存后需温浴重溶解。
4. 稀释梯度

5. 10%过硫酸铵

6. 2x 染色剂

2%溴酚蓝，2%二甲苯蓝，100%甘油
7. 1x TAE缓冲液

试剂（？）
去离子水（Millpore 纯化柱）
丙烯酰胺，双丙烯酰胺
尿素
Tris
EDTA
乙酸
甲酰胺
TEMED （tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺）
过硫酸铵
Triton
硝酸银
100%乙醇
NaOH
甲醛
溴酚蓝
二甲苯蓝
甘油。
第二部分：DGGE 操作步骤
1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。
2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml 的注射器上。
3. 在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。
4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到14.5。
5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。
6. 每管加入18 μl TEMED，80 μl 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。
7. 通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。
8. 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同Y 形管相连。
9. 轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。
10. 小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。
11. 迅速清洗用完的设备。

12. 聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。（以上为制胶过程）
13. 用注射针点样（预先准备好的16S rDNA V3 区PCR 扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化）。
14. 电泳（200V，5h）。
15. 电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。

16. 倒掉去离子水，加入250 ml 固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置15min。
17. 倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 银染液（0.2% AgNO3, 用之前加入200μl 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色15min。
18. 倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）显色。
19. 待条带出现后拍照。
TGGE 操作步骤
1. 去离子水仔细洗涤制胶所用玻璃板，用纸巾擦干。再用酒精棉球擦一遍，用纸巾擦干。将支持膜夹在两块玻璃板之间，用夹子夹住，放置在桌上。
2. 配胶 (每块胶配5ml)
胶的组成
储存溶液
5ml胶
丙烯酰胺(8%)
40%
(37.5:1)
尿素(8M)

2.4g
TAE
50×
0.1ml
甲酰胺(20%)
100%
1ml
ddH2O

1.22ml
TEMED

7μl
过硫酸胺
10%
23
3. 将玻璃板倾斜放置，用1ml 的移液器将上面配置的胶慢慢灌入两玻璃板之间。将玻璃板水平放置半小时以上，使胶凝固。
4. 待胶凝固后，先用手拨去没有点样孔的玻璃板。用去离子水将支持膜背面冲洗干净，用纸擦干。再揭开支持膜。
5. 用1ml 移液器在TGGE 的温度面板（如图, thermoblock）上加800 μl 0.1% Triton。

TGGE铺膜示意图

6. 用手抓住支持膜的两边，先将膜中部放于加热面板上，再慢慢将膜铺展开，在膜和加热面板间尽量不要形成气泡。温度梯度方向和电泳方向一致。
7. 将预先准备好的样品加入上样孔中，每孔最多加3 μl 样品。
8. 在胶的两端盖上Waterman 滤纸（图，buffer wick），滤纸的另一端浸入电泳缓冲液中。
9. 盖上盖子，预电泳（200V，7min）。
10. 预电泳快结束时（6min 50sec），暂停反应。打开盖子，揭开滤纸。在凝胶中间慢慢盖上一层塑料膜（图6，cover film）。再将滤纸盖在胶上，然后用一块玻璃板（图6，coverplate with sealings）压在滤纸上。
11. 盖上盖子，继续电泳（200V，3h）。
12. 电泳结束后，终止程序。将支持膜取出，先用去离子水冲洗一次。
13. 将膜转移至固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置5min。
14. 将膜转移至去离子水中冲洗一次，再转移至银染液（0.2% AgNO3, 用之前加入40μl 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色10min。
15. 将膜在去离子水中冲洗2 次，转移至显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）中。
16. 待条带出现后，将膜用去离子水冲洗3 次，拍照。

注意事项
DGGE
1． 配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。
2． 制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。
3． 灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
4． DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。
5． 点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。
6． 银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。
7． 每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。
TGGE
1. 配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。
2. 保护层（protection foil）用来保护温度面板（gradient block），要防止试剂浸入，每次用完后要把残余的试剂吸干。一旦破损，应停止使用，更换后再继续使用。
3． TGGE mini system T1~T2 之间的温度差不能超过45℃。
4． 支持膜和温度面板间一定要加0.1% Triton，从而确保能形成稳定的温度梯度。