生姜蛋白酶提取方法的改进.doc

生姜蛋白酶提取方法的改进
孙国梁，乔园园，唐晓珍*
(山东农业大学食品科学与工程学院，泰安，271018)
摘要：本实验在超滤法的基础上对生姜蛋白酶的提取方法进行改进。以超滤后所得的浓汁为酶源，加入等体积的丙酮后离心取沉淀，再用pH为5.5的缓冲液溶解，离心取上清液，然后加入固体硫酸铵至40%饱和度，离心取上清液继续添加固体硫酸铵至70%饱和度，离心取沉淀，即可得到初步提取的生姜蛋白酶。
关键词：生姜蛋白酶；酶活力
Inprovement of Extracting of Ginger Protease
Sun-Guoliang；Qiao-Yuanyuan；Tang-Xiaozhen*
(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018)
Abstract: Method of extracting ginger protease is improved base on the method of ultra filtration.Taking the concentrated juice from ultra filtration as the enzyme source ,acetone of the same volume is adding to it ,and then it is centrifuged.Deposition is dissolved in the buffer whose pH is 5.5, then centrifuged, the pellucid liquid is collected. Then solid ammonium sulfate is added to it until the saturation is 40%,then centrifuged, solid ammonium is added to the pellucid liquid on the top until the saturation is 70% ,and then centrifuged again,deposition is collected.Thus we can get ginger protease that is primary extracted.
Key word: Ginger protease; Proteolytic activity.
生姜蛋白酶作为一种肉类嫩化剂，对牛肉，鸡肉等具有良好的嫩化作用[1]，作为酒类澄清剂，对啤酒，葡萄酒等也具有良好的澄清作用[2]。因此生姜蛋白酶是有待研究开发的重要的植物蛋白酶。对生姜蛋白酶的性质进行研究，对改变我国长期以木瓜，菠萝等少数热带水果作为蛋白酶源的现状具有重要意义。
生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取法如丙酮，盐析沉淀法，如硫酸铵沉淀。这些方法具有提取纯度高的优点，但大都以丙酮粉为酶源，而丙酮粉的制备操作繁琐，消耗大量丙酮，成本高，效率低。因此，近几年逐步研究了一些新的提取方法。这些新的方法主要有乙醇沉淀法等。超滤法具有操作简单，成本低，效率高，无污染，无有害物质残留等特点，非常适合工业化生产。以前也有超滤法提取生姜蛋白酶的研究，但其是将超滤所得的浓汁直接冷冻干燥作为粗酶粉[3]。本实验在超滤法的基础上对生姜蛋白酶的提取方法进行了改进，以超滤后所得的浓汁为酶源，用丙酮沉淀法对其进行部分纯化，所得的生姜蛋白酶粉既能满足一般工业生产和应用的要求，也能满足一般酶学性质研究的要求。
1材料与方法
1.1实验材料：生姜，由潍坊神农食品公司提供，主要品种为姜母。
1.2主要仪器：多功能榨汁机；千岛超滤机；离心机；水浴锅；电子天平；分光光度计。
1.3测定方法：
1.3.1 生姜蛋白酶活力的测定方法，采用福林酚法[4]。
生姜蛋白酶活力的定义：在一定温度（40℃）下，每分钟分解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。标准曲线的制作见参考文献。本实验所得的标准曲线的方程为：y = 92.224x + 2.2894（n=6，R2=0.9963）
酶活力测定步骤：
蛋白酶液1.0mL与1.0mL0.5%的酪蛋白混合，40℃水浴下保温反应10min，加入2.0mL0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，静置10min后过滤。取1.0mL滤液与5.0mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1.0mLFlion-酚试剂混合，40℃下保温发色20min。对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量三氯乙酸以阻止反应发生。然后在680nm处，以对照调消光度0，测样品的吸光度。
1.4生姜蛋白酶的提取方法：
1.4.1基本工艺流程设计：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤（常温，工作压力）→取浓汁→加入丙酮→离心→取沉淀→用缓冲液溶解→离心取上清液加入硫酸铵至40%饱和度→低温静置24小时→离心→取上清→加入硫酸铵至70%饱和度→低温静置24小时→离心→取沉淀→缓冲液溶解→透析→浓缩干燥→部分纯化的生姜蛋白酶粉。
1.4.2传统工艺比较分析
取生姜100g两份，一份按照前人的方法制成丙酮粉8g，用20ml缓冲液浸提，离心过滤后得浸提液；另一份经超滤得浓汁20ml。分别测丙酮粉浸提液和浓汁中的生姜蛋白酶的酶活。
1.4.3丙酮沉淀条件的确定
1.4.3.1按照超滤的工艺流程与条件进行操作[15]，得到超滤后的浓汁与清汁对二者进行比较，确定生姜蛋白酶是在浓汁或清汁中。
1.4.3.2利用丙酮沉淀超滤后的浓汁，得到丙酮沉淀和上清液。用与超滤浓汁等体积的pH5.5的缓冲液溶解丙酮沉淀，分别测上清液和沉淀溶解液的酶活，比较丙酮沉淀与上清液的酶活，确定生姜蛋白酶是在沉淀或清汁中。
1.4.3.3加入不同量的丙酮，测定丙酮沉淀的重量、酶活、单位重量沉淀中酶活力，探讨丙酮量对丙酮沉淀法提取生姜蛋白酶的影响。
1.4.4缓冲液pH值的影响
取浓汁5ml，按1：1的体积比加入在-20℃下预冷的丙酮，3000r/min，离心10min后取沉淀，然后分别用5ml不同pH值的缓冲液溶解，测定其中的酶活以及蛋白质含量。
1.4.5硫酸铵沉淀条件的确定
取浓汁5ml，按1：1的体积比加入在-20℃下预冷的丙酮，3000r/min，离心10min后取沉淀，然后分别用5ml pH5.5值的缓冲液溶解，3000r/min，离心10min后取上层液体，加入固体硫酸铵至20%饱和度，静置24小时后离心取沉淀，用20ml缓冲液溶解，用透析袋对蒸馏水透析至对氯化钡检验无沉淀产生，然后调整其pH值为6.0，测定其中的酶活以及蛋白质含量。上清液中继续添加固体硫酸铵至30%饱和度，重复上述操作，直至70%的饱和度。
2结果与分析
2.1 传统工艺比较结果
表1丙酮粉浸提液与超滤所得的姜汁酶活得比较
Table 1 Comparison between concentrated juice and acetone extraction
样品
吸光度
丙酮粉浸提液
0.023
超滤所得的浓汁
0.340
张平平等前人的工艺操作都是以丙酮粉为酶源，进行丙酮沉淀等后续操作，而本实验的改进之处是以超滤后的姜汁为酶源进行后续实验。由表1可以看出，改进后的工艺操作提取的酶的酶活较高，说明我们的改进方案是可行的。
2.2丙酮沉淀条件的确定
2.2.1超滤所得浓汁与清汁的比较
取浓汁，清汁，以蒸馏水为空白，以0.5%酪蛋白为底物测活，结果如表2所示（注：以测得的吸光度来定性判断酶的存在）。
表2 超滤所得浓汁和清汁的比较
Table 2 Comparison between concentrated juice and pellucid juice from ultra filtration
样品
吸光度
浓汁
0.438
清汁
0.010
由此可见，生姜蛋白酶主要存在于超滤后所得的浓汁中。这与前人研究的结果一致[3]。
2.2.2丙酮沉淀与上清的比较
取浓汁5ml，加入等体积丙酮，3000r/min离心10min后，沉淀用pH5.5的缓冲液5 ml溶解。分别测定上清和沉淀中的酶活，结果表3所示。
表3沉淀与上清的比较
Table 3 Comparison between deposition and pellucid liquid
样品
吸光度
上清液
0.008
沉淀
0.304
由此可见，生姜蛋白酶主要存在于沉淀中。需要说明的是，上清液中尽管酶活很低，但在测活时显色的时候溶液的颜色很深，而沉淀中尽管酶活很高，但在测活时显色的时候溶液的颜色很浅。这说明浓汁中含有大量的性质与酪氨酸相似的一类的能使福林试剂显色的物质，而且在丙酮中能够溶解，且这类物质与生姜蛋白酶活性作用的发挥无关。
2.2.3加入丙酮的量的影响
2.2.3.1 加入丙酮的量对沉淀重量的影响

图1加入丙酮的量对沉淀重量的影响
Fig 1 Effect of volune of acetone on the weight of the precipitation
由图1可知，当丙酮与浓汁的体积比在0.8~1.4的时候，随着丙酮与浓汁的体积比的增加，产生的沉淀的重量不断增加，而当其体积比大于1.2的时候，二者的体积比对产生沉淀的重量的影响并不明显，只是当其体积比为1.6：1时，沉淀重量有所减少，为0.388g。这说明生姜汁经超滤后的浓汁中含有大量的蛋白质，且当丙酮与浓汁的体积比在1.2的时候，蛋白质已经沉淀完全。
2.2.3.2加入丙酮的量对沉淀酶活的影响

图2加入丙酮的量对沉淀酶活的影响
Fig 2 Effect of volune of acetone on the proteolytic activity. of the precipitation
由图2可知，随着丙酮与浓汁的体积比的增加，由等体积的浓汁所产生的沉淀中所含有的总的酶活力在二者的体积比大于1的时候相差不大。而当二者的体积比为0.8的时候，沉淀中的酶活仅有46.635，大约是后续各个样品的2/3左右。这就说明了在浓汁中加入不同体积的丙酮后，首先产生的沉淀是生姜蛋白酶，而随着丙酮体积的增加，所产生的其他沉淀与生姜蛋白酶的活性无关。
2.2.3.3加入丙酮的量对单位重量的沉淀中酶活力的影响

图3 加入丙酮的量对单位重量的沉淀中酶活力的影响
Fig 2 Effect of volune of acetone on the proteolytic activity of the precipitation
由图3可知，随着丙酮与浓汁的体积比的增加，由等体积的浓汁所产生的单位重量的沉淀中所含有的酶活力逐渐减少。这进一步说明了随丙酮与浓汁体积比的增加，所产生的新的沉淀非生姜蛋白酶。
总结上述分析，本试验采用丙酮与浓汁的体积比为1：1来使浓汁中的生姜蛋白酶沉淀。
2.3硫酸铵沉淀条件的确定
2.3.1溶解丙酮沉淀时所用缓冲液的pH的对沉淀中酶活力的影响

图4溶解丙酮沉淀时所用缓冲液的pH的对沉淀中酶活力的影响
Fig4 Effect of pH of the buffer on the proteolytic activity in the supernatant
由图4可知，当pH为5.5的时候，生姜蛋白酶的活性最大。这说明不同的生姜品种中所含的生姜蛋白酶的性质有所不同，这还需要进一步的研究。

表4 硫酸铵沉淀的结果
Fig 4 Results of ammonium sulfate deposition
馏分
沉淀重量（g）
酶活（U/mL）
蛋白含量（mg）
比活（U/mgPr）
0~30%
8.9523
5.218
1.61
3.25
30%~40%
8.9412
6.202
3.25
1.91
40%~50%
1.8456
8.015
2.14
3.75
50%~60%
1.0372
4.072
1.82
2.24
60%~70%
0.8602
10.12
1.12
9.03
2.3.2硫酸铵饱和度梯度对沉淀重量的影响
由表4可知，随着硫酸铵饱和梯度的增加，沉淀的重量逐渐减少，在30%饱和度和40%饱和度时沉淀的含量达到最大，可以推断：在30%饱和度时沉淀的主要成分可能是非蛋白杂质，在40%饱和度时，可能是由于杂质蛋白在此饱和度时大部分被沉淀下来，故沉淀重量较高，随着饱和度的增大杂质蛋白不断地被沉淀下来，但其含量不断的减少。
2.3.3硫酸铵饱和度梯度对沉淀中酶活的影响
由表4可知，从30%到50%的硫酸铵饱和度范围内，随着硫酸铵饱和度的增加，生姜蛋白酶活力也在增加，达到60%饱和度时其酶活力有所下降，当达到70%饱和度时生姜蛋白酶的活力最高，这说明随着硫酸铵饱和度的增加其总趋势是所沉淀的目的蛋白的含量越来越多，其酶活力亦愈来愈大，70%的饱和度时目的蛋白的含量最高，在后续实验中可以使用70%饱和度的硫酸铵来提取生姜蛋白酶，使其得率较高。
2.3.4硫酸铵饱和度梯度对沉淀中蛋白含量的影响
由表4可知，随着硫酸铵饱和梯度的增加，沉淀中的蛋白含量先增加在减少，在40%饱和度时沉淀的含量达到最大，可能是由于杂质蛋白在此饱和度时大部分被沉淀下来，故蛋白含量较高，随着饱和度的增大杂质蛋白不断地被沉淀下来。
2.3.5硫酸铵饱和度梯度对沉淀中比活力的影响
由表1可知，随着硫酸铵饱和度的增加，沉淀中酶的比活力呈现不规律的变化，30%饱和度的酶活力大于40%饱和度的活力，50%饱和度的酶活力大于60%，比活力最高是在70%硫酸铵饱和度范围内，说明在此饱和度内，目的蛋白含量最高。
2.3.6硫酸铵沉淀小结
由以上对不同的硫酸铵饱和梯度条件下对蛋白质沉淀重量、沉淀中酶活、沉淀中生姜蛋白酶含量及沉淀中生姜蛋白酶不活力的影响的分析可知：在70%硫酸铵饱和度时，生姜蛋白酶的酶活力最高、比活最高，其纯度也最高，而在40%饱和度以前所产生的沉淀，尽管其中的蛋白含量较高，但其酶活力较低，因而比活力也较低，这就说明在此饱和度以前所产生的沉淀大部分是杂蛋白，因此可先在丙酮沉淀的缓冲液溶解液中添加固体硫酸铵至40%饱和度，离心去除沉淀以后再在上清液中继续添加固体硫酸铵至70%饱和度，离心取沉淀，其主要成分便为生姜蛋白酶，在此基础上对生姜蛋白酶进行提取纯化可得到相对较好的结果。这与张平平的研究结论并不一致，可能与生姜的品种以及提取方法有关。
3 结论
本实验在超滤法的基础上，对生姜蛋白酶提取的方法进行了改进。结果表明：生姜洗净，切碎后，榨汁，经离心，抽滤去除淀粉以及其它大颗粒杂质后用超滤机在常温，工作压力下进行超滤，然后以超滤所得的浓汁为酶源，加入等体积的丙酮后离心取沉淀，再用pH为5.5的缓冲液溶解，离心取上清液，然后加入固体硫酸铵至40%饱和度，离心取上清液继续添加固体硫酸铵至70%饱和度，离心取沉淀，浓缩干燥，即可得到初步提取的生姜蛋白酶。
【参考文献】
[1]唐晓珍，黄雪松等.生姜蛋白酶和生姜汁对猪肉嫩化效果的比较.山东农业大学学报（自然科学版）， 2003，34（1）：15～18
[2]唐晓珍，黄雪松等.生姜蛋白酶对啤酒的澄清效果.食品工业科技，2002，23（8）：12~14
[3]唐晓珍，位思清等. LS1型科研型超滤机制备生姜蛋白酶的研究.包装与食品机械.，2002，20（4）：1~4
[4]中华人民共和国国家标准.工业用蛋白酶制剂活力的测定.1994
[5]代景泉，黄雪松. 生姜蛋白酶的分离纯化.食品科学，2004，24（2）：73~79
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