黄花苜蓿发明 附件.doc

说 明 书

黄花苜蓿组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及野生牧草繁殖方法，具体指黄花苜蓿组培快速繁殖方法。
背景技术：
黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种分布广泛的野生豆科牧草，与紫花苜蓿相比，黄花苜蓿具有耐寒、抗病虫害、抗逆性强等特点。在我国干旱、寒冷地区推广种植黄花苜蓿能发挥重要的生态、经济价值。但是，由于黄花苜蓿是野生种，自身也有一些缺点，如：黄花苜蓿花期不一致，这导致种子成熟不一致、收获产量低，硬实率高达83%、发芽率较低。这都影响了黄花苜蓿的扩大种植。因此，提高黄花苜蓿种子产量及繁殖系数有着重要的理论价值及现实意义。目前，国内外对黄花苜蓿的研究主要集中在栽培引种驯化、遗传多样性及抗性基因等方面，其中涉及种子发芽及繁殖体系的相关研究报导较少。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种黄花苜蓿组培快速繁殖方法,这种方法具有繁殖速度快、成本低、培育周期短的特点。
本发明要解决的技术问题由如下方案来实现：黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的灭菌，无菌苗的获得，愈伤组织的诱导及分化，植株的再生，炼苗移栽。具体方法如下：
一、种子的灭菌及无菌苗的获得：取黄花苜蓿种子在流水条件下冲洗20～30min，用浓度为70%的乙醇浸泡20～40s，浓度为0.1% HgCl2消毒4～12 min，置于MS和1/2MS固体培养基中发芽，获得无菌苗；
二、愈伤组织的诱导：取上述无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成4 mm×4mm、下胚轴切割成4mm，接入愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基为MS+浓度为0.5～2mg/L 2,4-D+浓度为0～1.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH值均调至5.89～5.92，经高温120℃高压灭菌20min，在19～25℃室内散射光条件下培养，即获得愈伤组织；
三、分化培养及植株的再生：将上述愈伤组织转接到分化培养基上，分化培养基为MS+浓度为0.15～1.5mg/L KT+浓度为0.1～0.2mg/L NAA+0.7%琼脂，初次分化时加蔗糖3%、继代时加蔗糖2%， pH值均调至5.89～5.92，经高温120℃高压灭菌20min，在19～25℃室内散射光并开白炽灯条件下培养，培养约50d，即可再生出部分完整的分化苗；
四、炼苗及移栽：炼苗移栽前，去掉封口膜，将完整的分化苗进行炼苗1～2d，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。
本发明与现有技术相比所具有的优点：
1、黄花苜蓿种子硬实率较高，前处理采用砂纸打磨，破除硬实，发芽率可提高64.9%。
2、黄花苜蓿种子在打磨，流水下冲洗20min，散射光未开白炽灯室内培养条件下，用0.1%的升汞消毒8min后，其发芽率最高，可达79.6%。
3、利用组织培养技术在短期内可获得黄花苜蓿大量愈伤组织和再生苗，分化率高达80%。
附图说明
图1为黄花苜蓿组培快速繁殖方法流程图。
具体实施方法
一、种子的灭菌及无菌苗的生产
选取大小一致，光滑饱满的黄花苜蓿种子(打磨和未打磨)用比重清选法进行清选，下沉的种子作为试验样品。将种子在流水下分别冲洗20～30min，移入超净工作台，70%的酒精浸泡20～40s，用0.1%的升汞消毒不同时间梯度后（4～12min），无菌水冲洗4～5遍，接种于MS和1/2MS固体培养基中，培养温度为19～25℃，培养条件为室内散射光并开白炽灯下培养、室内散射光未开白炽灯培养和培养箱光暗交替培养(光：暗=16：8)，发芽8d左右，观察种子无菌苗萌发及生长状况。
二、愈伤组织的诱导
取上述发芽8d左右的无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成4×4mm、下胚轴切割成4mm左右，接入经高压灭菌的愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基成分如下：基本培养基MS，蔗糖3%，琼脂0.7%，激素种类及用量见表1。pH值均调至5.89～5.92，在19～25℃室内散射光条件下培养，约4d左右开始形成愈伤，3周后进行数据统计。
表1 黄花苜蓿愈伤组织诱导培养基激素种类与用量
激素种类
激素浓度(mg/L)
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
2,4-D
6-BA
0.5
0
0.5
0.5
0.5
1
0.5
1.5
1
0
1
0.5
1
1
1
1.5
2
0
2
0.5
2
1
2
1.5

三、愈伤组织分化及植株再生
将上述诱导出的胚性愈伤组织转接到分化培养基中，分化培养基成分如下：基本培养基MS，初次分化时蔗糖3%，继代时蔗糖2%，琼脂0.7%，激素种类及用量见表2。pH值均调至5.89～5.92，经高温120℃高压灭菌20 min，在19～25℃室内散射光并开白炽灯条件下培养，每隔20d继代1次。培养50d后，即可再生出分化苗，并且40%以上分化苗都会有根系产生。将未形成根系的分化苗放入生根培养基中，20d后长出幼根。
表2 黄花苜蓿愈伤组织分化培养基激素种类与用量
激素种类
激素浓度(mg/L)
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
NAA
KT
0.1
0.15
0.1
0.5
0.1
1
0.1
1.5
0.2
0.15
0.2
0.5
0.2
1
0.2
1.5
四、炼苗及移栽
1)炼苗：移栽前，去掉封口膜，加入无菌水，炼苗1～2d；
2)移栽：将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基，注意不要伤了苗和根，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，移栽时用镊子将无菌苗根部及茎基部1～2个节置于基质中，浇水(注意：浇水量需适中，过多的水会使其根部腐烂，无法形成正常植株)，使根部与土壤密切接触，覆上遮阴网，保湿保温，防止幼苗萎蔫，使其尽快缓苗。经10 d后，幼苗长出新叶，标志幼苗成活，揭去遮阴网。

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权 利 要 求 书

1、黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的灭菌，无菌苗的产生，愈伤组织的诱导及分化，植株的再生，炼苗移栽，其特征是：
一、种子的灭菌及无菌苗的获得：取黄花苜蓿种子在流水条件下冲洗20～30min，用浓度为70%的乙醇浸泡20～40s，浓度为0.1% HgCl2消毒4～12 min，置于MS和1/2MS固体培养基中发芽，获得无菌苗；
二、愈伤组织的诱导：取上述无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成4 mm×4mm、下胚轴切割成4mm，接入愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基为MS+浓度为0.5～2mg/L 2,4-D+浓度为0～1.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH值均调至5.89～5.92，经高温120℃高压灭菌20min，在19～25℃室内散射光条件下培养，即获得愈伤组织；
三、分化培养及植株的再生：将上述愈伤组织转接到分化培养基上，分化培养基为MS+浓度为0.15～1.5mg/L KT+浓度为0.1～0.2mg/L NAA+0.7%琼脂，初次分化时加蔗糖3%、继代时加蔗糖2%， pH值均调至5.89～5.92，经高温120℃高压灭菌20min，在19～25℃室内散射光并开白炽灯条件下培养，培养约50d，即可再生出部分完整的分化苗；
四、炼苗及移栽：炼苗移栽前，去掉封口膜，将完整的分化苗进行炼苗1～2d，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。

说 明 书 摘 要

本发明公开了一种黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的处理、无菌苗的获得、愈伤诱导、增殖、分化、再生植株的获得及炼苗移栽等技术。本试验以黄花苜蓿无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，接种到不同激素配比的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤形成，然后接种到分化培养基中分化成苗。将完整的分化苗进行炼苗，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。本方法能得到较高的种子发芽率及组培苗分化率。

摘 要 附 图

黄花苜蓿微繁程序
流水冲洗
打磨种子

未开白炽灯室内培养
开白炽灯室内培养
未打磨种子
愈伤培养
分化培养
光暗交替培养
无菌苗的获得
分化苗
炼苗移栽

图 1
说 明 书 附 图

黄花苜蓿微繁程序
流水冲洗
打磨种子

未开白炽灯室内培养
开白炽灯室内培养
未打磨种子
愈伤培养
分化培养
光暗交替培养
无菌苗的获得
分化苗
炼苗移栽

图 1

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