β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用.pdf

李云亮，谢鹏飞，刘晓霜，等.-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用 J.食品工业科技，2023，44（23）：387393.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030097LI Yunliang,XIE Pengfei,LIU Xiaoshuang,et al.Source,Modification,Heterologous Expression of-Galactosidase and ItsApplicationinFoodJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):387393.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030097 专题综述-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用在食品中的应用李云亮1,2，谢鹏飞1，刘晓霜1，晁嘉品1，赵晓雪1，王晓静1，马海乐1,2,*（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212000；2.卫仕宠物营养科学研究院（江苏）有限公司，江苏镇江212000）摘要：-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂，不仅广泛应用于食品工业领域中，而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产-半乳糖苷酶的主流生产方法，仍存在发酵时间较长、提取率低等问题；而利用工程菌的异源表达系统生产-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述，旨在为新型-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。关键词：-半乳糖苷酶，应用价值，基因改造，固定化，异源表达本文网刊:中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：10020306（2023）23038707DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023030097Source,Modification,HeterologousExpressionof-GalactosidaseandItsApplicationinFoodLIYunliang1,2，XIEPengfei1，LIUXiaoshuang1，CHAOJiapin1，ZHAOXiaoxue1，WANGXiaojing1，MAHaile1,2,*（1.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212000,China；2.WeishiPetNutritionResearchInstitute(Jiangsu)Co.,Ltd.,Zhenjiang212000,China）Abstract：-galactosidase,asasafeandnontoxicenzymepreparation,hasbeennotonlywidelyusedinfoodindustryandmedicalfields,butalsohasgreatapplicationpotentialinbiotechnologyfields,suchasenzymeengineeringandproteinengineering.Microbialfermentation,asamainstreamproductionmethodof-galactosidase,stillhassomeproblemsinclu-dinglongfermentationtimeandlowextractionrate.Whileusingtheheterologousexpressionsystemofengineeringbacte-riatoproduce-galactosidaseshowstheadvantagesofhighexpressionquantityandlowcost.Thispaperfocusesonthegene source,expression host bacteria,expression methods of-galactosidase heterologous expression system and itsapplicationvalue,tobeaimedatprovidingscientificbasisandtheoreticalreferenceforthedevelopmentandutilizationofnovel-galactosidaseproducts.Keywords：-galactosidase；applicationvalue；genemodification；immobilization；heterologousexpression-半乳糖苷酶（-galactosidaseEC.3.2.1.23），全称为-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可通过切割乳糖中由-1-4-糖苷键连接的 D-半乳糖残基，使乳糖降解成为可被机体吸收的-半乳糖和葡萄糖1。-半乳糖苷酶来源丰富2，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中。在幼年哺乳动物的皮肤、特别是小肠等收稿日期：20230309基金项目：国家自然科学基金-青年项目（31701538）；江苏省卓越博士后计划资助（2023ZB055）。作者简介：李云亮（1986），男，博士，讲师，研究方向：食品生物技术，E-mail：。*通信作者：马海乐（1963），男，博士，二级教授，研究方向：食品物理加工技术，E-mail：。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.2023器官组织中存在丰富的-半乳糖苷酶34，而成年个体的消化道内-半乳糖苷酶含量较低，无法很好地分解和利用乳糖；虽然很多食物、植物中均发现了-半乳糖苷酶，如番茄5、水稻6、拟南芥7、苹果8和咖啡豆9等，然而植物来源的-半乳糖苷酶在组织中含量并不高，因此提取得率较低10；微生物中-半乳糖苷酶资源很丰富，大肠杆菌、酵母菌、霉菌等细菌、真菌均能产-半乳糖苷酶。目前商业化使用的-半乳糖苷酶主要采用大肠杆菌、黑曲霉等微生物发酵法制备，但存在酶活不高、稳定性较差等问题，且很多微生物发酵产物多以胞内酶的形式存在，导致酶纯化工艺复杂、成本增加。为解决此类问题，研究学者对-半乳糖苷酶基因进行异源表达，或者将其改造后再进行异源表达，即将-半乳糖苷酶基因转入至外源宿主菌11中，利用宿主细胞自身代谢资源（能量分子、氨基酸等）来实现表达12，展现了良好的应用前景。基于此，本文对-半乳糖苷酶的应用、-半乳糖苷酶基因的来源及其异源表达、表达宿主和表达方式展开综合论述，为-半乳糖苷酶的开发与改良提供科学依据与理论参考。1-半乳糖苷酶的来源及改造1.1-半乳糖苷酶来源目前 NCBI 中登记的-半乳糖苷酶基因已有1.7 万余个，图 1 中显示真核生物共 12188 个、细菌4393 个、古生菌 415 个以及病毒 19 个（截止 2023.04.06）。同一家族来源的-半乳糖苷酶具有相似的催化机制，不同家族来源的-半乳糖苷酶则在酶学性质上有着较大差异，表 1 列出了较为常见的不同来源的-半乳糖苷酶特性。贺璐等13发现细菌来源的-半乳糖苷酶多为常温酶，如大肠杆菌和保加利亚乳杆菌来源的-半乳糖苷酶最适反应温度一般在40 左右，最适作用 pH 在 6.57.5 之间。酵母菌来源的-半乳糖苷酶具有较强的水解活性14，常用于牛乳和乳清中乳糖的水解。霉菌来源的-半乳糖苷酶最适反应温度通常在 50 以上，最适 pH 偏酸性，其中黑曲酶15来源的-半乳糖苷酶耐热耐酸性较强，可用于干酪、牛乳和酸性乳清的水解处理，而米曲霉16来源的-半乳糖苷酶则具有较强的转糖基活性，可用于生产低聚半乳糖。表1不同来源-半乳糖苷酶特性Table1Characteristicsof-galactosidasefromdifferentsources来源分子量（kDa）最适温度（）最适pH酶活力（Umg1）大肠杆菌17540407.2430保加利亚乳杆菌1822042457.0NT嗜热乳酸杆菌1953055576.27.5530嗜热脂肪芽孢杆菌20215656.06.4215乳酸克鲁维酵母21135356.97.3135脆壁克鲁维酵母22201376.6201黑曲霉2312455602.54.0142米曲霉249050555.090蚕豆2570504.0NT番茄57150554.04.416狗头枣263570504.570猪3313750554.0NT山羊272217503.54.5NT皱瘤海鞘256975774.0NT注：NT：NotTaken，即文献中未记录的数据。1.2-半乳糖苷酶改造天然微生物以及动植物中的-半乳糖苷酶存在热稳定性差、酶活低等问题，往往不能很好地满足目前工业发展需求，可通过分子进化手段对-半乳糖苷酶基因进行定向改造，将其在体外模拟随机突变28、重组，使得目的基因发生大量变异，筛选获得具有特定性质的目的基因。彭慧等29将来源于 T.sc-otoductus 的野生型-半乳糖苷酶 GaLT0 的 N 端氨基酸序列插入一个经过人工改造的双亲短肽序列（AEAEAKAKAEAEAKAKAEAEAKAK），经改造后的-半乳糖苷酶，稳定性更高，55 环境下半衰期提高了 10 倍，2h 内可水解牛奶中 95%的乳糖。杨萍30通过将来源于米曲酶的乳糖酶基因作为出发点，通过 PCR 引物设计，对基因序列中第 211 位氨基酸进行改造，将 Thr 突变为 Asn、Asp、Ser、Pro 和Gly，发现当第 211 位氨基酸突变为 Pro 后，在 60环境下的半衰期相对于野生型的 2.06min 提高到177.73min，极大地改良了乳糖酶的热稳定性。对-半乳糖苷酶基因的改造不仅局限于使其具有更广泛的环境适应范围，还可以增加自身表达水平、提高酶活力。李晨霞等31通过易错 PCR 技术构建了米曲霉-半乳糖苷酶（AoBgal35A）的突变体文库32并对其进行分析，发现 AoBgal35A 中第 955 位的苏氨酸（Thr）突变为丙氨酸（Ala），使得极性残基突变为非极性残基，最终获得的-半乳糖苷酶的最适 pH 提高了 0.5，酶活达 4760U/mL，是目前米曲酶来源的-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中获得的最高表达水变形菌门(1476)放线菌门(320)细菌(4393)CFB组菌(761)厚壁菌门(1678)古生菌(415)其它(158)-半乳糖苷酶(17018)病毒(19)植物(4703)真核生物(12188)真菌(2417)动物(4917)图1已登记-半乳糖苷酶基因来源（截止 2023.04.06）Fig.1Registeredgenesourcesof-galactosidase（until2023.04.06）388食品工业科技2023 年12月平。目前随着研究的不断深入，日趋成熟和完善的多种新型分子进化技术如 DNA 改组33、易错 PCR34、交错延伸等方法将有望成为-半乳糖苷酶基因改造的有效工具。2-半乳糖苷酶的异源表达系统选择合适的表达系统是使-半乳糖苷酶基因得以高效表达的关键因素，目前-半乳糖苷酶异源表达的系统主要分为原核生物和真核生物表达系统，表 2 列出了目前常用的表达系统及其特点。2.1原核表达系统原核表达系统中最常见的是大肠杆菌表达系统40，大肠杆菌生长速度极快，具有连续发酵的能力，以及表达量高、生产成本低41、遗传背景清晰42等特点，利用其作为表达宿主表达-半乳糖苷酶基因，技术路线成熟、可行性高43。陈卫等44将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的-半乳糖苷酶基因连接至大肠杆菌表达载体 pET-20b 中，转化至大肠杆菌 BL21 中诱导表达的重组蛋白比酶活为 6.66U/mg 蛋白，相比于出发菌株提高了 50 倍。徐顺清等45将来源于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a（+）上，转化至大肠杆菌 BL21 后 28 诱导 4.5h，测得乳糖酶酶活为 44.78U/mL 发酵液，但在添加 Ca2+、Zn2+、Fe2、CO2+、Mg2+和 Mn2+金属离子后，酶活分别提高了 18.53%、54.49%、293.65%、347.56%、422.95%和 549.81%，而 Cu2+的添加使得酶活完全被抑制，这为之后完善-半乳糖苷酶发酵体系提供了理论依据。利用大肠杆菌表达系统生产-半乳糖苷酶时，若稀有密码子连续出现，则会一直蛋白质的合成，发生密码子错配等现象，所以可在基因的设计前进行密码子的优化，如非连续性多核苷酸定点突变法对 cDNA 中稀有密码子进行定点突变，或提高某种氨基酸的 tRNA 浓度等。此外，蛋白在表达过程中会存在内毒素等有害物质残留风险，限制了其在食品领域的应用，所以食品级表达系统的建立对-半乳糖苷酶的生产也是十分重要的。乳酸菌，如乳酸乳球菌、乳杆菌和嗜热链球菌等属于安全的益生菌46，利用其作为表达的宿主菌，具有较高的安全性，近些年来该表达系统正成为研究的热点。孙芝兰等47将 Paenibacillussp.K1 乳糖酶基因构建至载体 pSEC 和 Pmg36e 上，电击转化至乳酸乳球菌（Lactococcus lactisMG1614）中，其表达后获得的-半乳糖苷酶对 1%的乳糖进行发酵，乳糖残余量为 0.56%，水解率增加一倍。由于乳酸乳球菌具有较高的食品安全特性，可使用其系统进行食品工业中相关蛋白酶制剂的开发。乳酸菌表达系统大多都是胞内表达，自身也存在分泌困难48等问题，而芽孢杆菌表达系统与乳酸菌表达系统相比，具备较强的分泌高活性蛋白的能力49。许俊勇等50首次将来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）的-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢中进行异源表达，经过 3L 罐的高密度培养，最终获得的酶活为 138.29U/mL，是普通摇瓶发酵的 20.3 倍。利用上述原核表达系统表达的-半乳糖苷酶以游离酶的形式表达时，可采用酶固定化的方法增强其稳定性和重复使用性，如包埋法51、吸附法52等，但这些方法存在操作过程复杂、成本较高的缺点。为了简化工艺，酶自固定化法应运而生，自固定化指的是酶（或融合酶）在特定条件下，自发形成不溶状态的过程，可采取将含有水不溶性的融合标签基因和可溶性酶基因组合在一起，使酶以不溶性包涵体的形式表达。王晓静53以李云亮54构建的金枪鱼多肽 TunaAI32 聚体基因为基础设计出了两种水不溶性的融合标签基因，并与乳糖酶基因进行融合表达，该自固定化乳糖酶的热稳定性比市售乳糖酶更强，在 60 保温 1h 后相对酶活仍达到 57.35%，其在低温环境中储藏 10d，仍可保持 90%以上的酶活，展示出了良好的应用前景。因此自固定化融合标签开发和设计可成为今后科研人员的研究重点之一。2.2真核表达系统真核表达系统相对于原核表达系统具有翻译后的加工修饰功能49，内部具有严格调控基因55的能力，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质，利用这一特点，真核表达系统常被用于具有复杂结构蛋白质的表达，其中以酵母表达系统最为常见56。王敏等57将来源于米曲酶-半乳糖苷酶的基因片段转化至乳酸克鲁维酵母 GG799 中，在连续发酵 120h 后，获得的蛋白酶活为 120.65U/mL，由于 Pklac1 载体含有真菌乙酰胺酶基因，发酵过程中不用添加任何抗生表2常见表达系统特点Table2Characteristicsofcommonexpressionsystems表达系统类型具体表达系统常用宿主适用范围优点缺点原核表达系统大肠杆菌表达系统35BL21、Rosetta蛋白质、抗体的生产遗传背景清晰、成本低、适合大规模培养易形成包涵体枯草芽孢表达系统36枯草芽孢杆菌工业酶制剂的生产蛋白分泌能力强且不含有内毒素表达质粒较不稳定乳酸菌表达系统37乳酸球菌、乳酸杆菌 食品工业中蛋白酶制剂的开发安全、操作简单穿梭载体转化效率低真核表达系统哺乳动物表达系统38哺乳动物细胞重组蛋白药物的生产能够指导蛋白质正确折叠细胞株稳定性差、生产成本较高酵母表达系统39粟酒裂殖酵母、酿酒酵母酿酒行业、面包生产具有翻译后加工能力蛋白表达量较低第44卷第23期李云亮，等：-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用389素，获得的-半乳糖苷酶经过超滤即可获得较纯酶液，简化了后期处理过程。而酿酒酵母作为表达宿主也适合用于酿酒工业和面包等食品的生产加工过程中。酵母表达系统虽增加了蛋白胞外分泌的可能性，使得蛋白纯化过程相对于胞内表达系统更加容易，但酵母表达系统也存在着分泌蛋白量少，发酵密度低的问题。而在哺乳动物表达系统中，可采用哺乳动物细胞作为表达宿主，通过其表达的外源蛋白接近于天然蛋白质，可用于重组药物的生产中，但在表达过程中，外源蛋白的生物学活性与宿主免疫原性有时也会产生差别，导致蛋白不能持久稳定表达。此外，此系统所用的表达宿主价格较为昂贵，不太符合大规模对于-半乳糖苷酶的工业化生产中。对于真菌表达系统，由于表达自身半乳糖苷酶系（-型和-型）的能力比较强，利用该类型宿主表达经改造后-半乳糖苷酶具有很大的价值，但目前相关研究较少，未来有必要对真菌表达系统开展深入研究，为其工业化应用打下基础。3-半乳糖苷酶在食品中的应用根据我国食品添加剂使用卫生标准 GB1886.174-201658，黑曲酶来源的-半乳糖苷酶可以作为食品添加剂进行使用。-半乳糖苷酶作为安全性较高的生物酶制剂，其水解乳糖活性及转糖基活性使其在食品工业等领域大有作为。3.1缓解乳糖不耐症问题乳糖不耐症是由负责消化乳糖的肠道-半乳糖苷酶的活性减少或丧失引起的一种疾病，其以乳糖吸收不良为特征，可能导致腹鸣、腹痛、腹泻和肠胃胀气等临床症状，在哺乳动物中普遍发生于羔羊、仔猫和仔犬等各种幼仔中。据统计在人体内-半乳糖苷酶的活性随年龄的增长而下降，少数人完全乳糖不耐受，成年人体内-半乳糖苷酶的活性仅为正常婴幼儿的 5%10%59。目前最有效的方法是在乳制品生产过程中添加-半乳糖苷酶以分解乳糖，制备低乳糖或者无乳糖的牛奶产品60。刘杰等61在牛乳中添加 0.65%的-半乳糖苷酶反应 2h 可水解 72.48%的乳糖，并与益生菌微胶囊混合制备了新型低乳糖益生菌乳粉。我国目前市面上的低乳糖奶制品62有零乳糖牛奶、无乳糖舒化奶等，都是通过在生牛乳中添加-半乳糖苷酶的方式降低乳糖含量。3.2生产低聚半乳糖低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）作为一种益生因子调理肠胃功能、可被肠道内青春双歧杆菌63、两岐双歧杆菌64、婴儿双歧杆菌65、长双歧杆菌66、短双歧杆菌67、干酪乳杆菌68、嗜酸乳杆菌69、唾液乳杆菌70等八种益生菌所利用，抑制有害菌的生长、维持肠道菌群生态平衡71、减少肠易激综合症的发生72，起到提高人体免疫力的作用73，极具市场开发价值。GOS 主流制备方法是酶法，即利用乳糖为原料，经-半乳糖苷酶催化水解及转半乳糖苷的作用，从而形成了由葡萄糖与乳糖组成的混合杂质低聚糖74。吴昊75研究了-半乳糖苷酶在 Mg2+作用下，GOS 的生产率为 31.37%远高于对照组，同时将 GOS 与抹茶粉进行复合，也解决了抹茶饮料沉淀的问题。据研究表明 GOS 不仅作为肠道菌群的益生元，也可作为食品添加剂使用，改善食品风味，提高产品质地，具有广阔的市场应用前景76。3.3改良乳制品在乳制品的加工过程中，由于乳糖溶解度较低，在浓缩乳制品或者冷冻乳制品时，一部分钙盐和乳糖结合导致蛋白质沉淀、乳糖结晶，使得产品口感下降77，故而在生产加工过程中添加-半乳糖苷酶水解乳糖，可以避免由乳糖引起的蛋白质聚集现象。另外，在酸乳生产加工中，因发酵周期长，李兴78发现添加-半乳糖苷酶可使酸乳凝固时间减少 15%20%，有效缩短发酵周期，且蔗糖用量和产品口感都有所改善79；在乳清的加工中，因乳清含有约 4%左右乳糖，添加-半乳糖苷酶后可产生乳清糖浆2，乳清糖浆甜度类似于蔗糖，但溶解度较乳糖提升了数倍，可作为蔗糖的替代品被用于乳清酒、乳清饮料的生产中80，极大地改善了产品的风味品质，同时拓宽乳清的使用范围。4结语与展望-半乳糖苷酶在缓解乳糖不耐受症、生产 GOS和改良乳制品等领域具有重要的应用价值。可将动植物，尤其是微生物来源的-半乳糖苷酶基因进行修饰后转入至大肠杆菌 BL21、酿酒酵母等表达宿主菌中，通过原核或真核表达系统进行异源表达，相对于传统发酵法，此方式可有效提高其产量与酶活，降低生产成本。但是目前主流的真核或原核表达系统依然存在纯化成本高、安全性偏低等问题，今后除了在现有的异源表达系统基础上开展大量、深度的研究外，还需要对兼具安全性和高分泌表达能力的表达系统进行探索；此外，如何开发新型载体和自固定化融合标签基因，以简化-半乳糖苷酶固定化的生产工艺并提高产品质量，也应是相关科研人员努力探索的方向之一。加大对-半乳糖苷酶的异源表达系统的研究力度，不仅对传统食品科学工程领域的发展具有重要意义，更有助于拓展-半乳糖苷酶在医疗、基因诊断治疗和环境监测等多个领域的应用范畴。参考文献1ZAMANU,REHMANKU,KHANSU,etal.Identification,kineticsandthermodynamicanalysisofnovel-galactosidasefromConvolvulus arvensis seeds：AnefficientagentfordelactosedmilkactivityJ.International Journal of Biological Macromolecules，2022（220）：15451555.2侯瑾,杨凯,薛冰,等.乳糖酶的性质及其在低乳糖乳制品中的应用J.食品安全导刊，2022，15（19）：172177.HOUJin,YANGKai,XUEBing,etal.Propertiesoflactaseanditsapplica-tioninlowlactosedairyproductsJ.FoodSafetyGuide，2022，15390食品工业科技2023 年12月（19）：172177.3何云山,吴仪,谭周进.猪肠道乳糖酶研究进展J.现代农业科技，2020，48（9）：208214.HEYunshan,WUYi,TANZhou-jin.ResearchprogressofintestinallactaseinpigsJ.ModernAgri-culturalScienceandTechnology，2020，48（9）：208214.4SONINK,TRIVEDIHH,KUMARS,etal.Areviewofdi-gestiveenzyme and 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