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基因工程随堂作业

题 目：离子束介导转基因技术简介

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离子束介导转基因技术简介
在植物转基因方法中,人们总是在全力寻找那些更为简单、有效而又通用的手段,以便绕过复杂的原生质体培养过程,实现带壁细胞的基因转移。于是,便开始了应用物理方法进行植物转基因的尝试,并获得了很大进展。其中较为成功的方法有电激法、基因枪或微弹轰击法、注射法、激光穿孔法和超声波法。这些方法就其本质来说,都是使细胞壁穿孔而又不伤害细胞,提供外源基因进入受体细胞的通道。
20世纪80年代末,由于受到离子注入金属、半导体等材料进行表面改性、掺杂等研究的启示,中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人,率先尝试将离子注入技术应用与生物材料,进行农作物品种的改良,并于1986年首次获得成功。至此,一个新兴的交叉学科离子束生物工程学问世,并日益受到国内外专家的关注。1991年余增亮等提出了离子束介导外源基因转移的设想,随后成功获得了水稻转基因植株。离子束介导转基因技术打破了传统的转基因法( PEG法、电击法、脂质体法等)操作繁琐,转化率低,重复性差,基因型依赖性强的限制,是一种较简单易行的转基因方法。
1. 离子束介导转基因技术的原理
植物细胞表面存在细胞壁,是外源基因转移的天然屏障。所有的转基因方法都是通过打破这一屏障,或以易于外源基因导入的细胞或组织(如原生质体、萌发胚、子房和幼穗等)作为受体而实现的。离子束介导转基因的原理主要包括了3个方面,即通道作用、吸引作用和整合作用。首先,一定能量和剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构,结果在局部产生刻蚀和穿孔,为外源遗传物质进入细胞提供微通道,这就是离子束对生物体的通道作用。其次,用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性(沉积作用) ,从而减弱了对带负电的外源DNA 的静电斥力,从而促进了外源DAN的吸附和进入,即产生吸引作用。再者,离子束的直接和间接作用打断细胞内的染色体DNA结构,有利于外源遗传物质整合到受体基因组中,即整合作用。
2　离子束介导转基因方法
2. 1　注入离子类型
离子束介导转基因技术目前所用的元素离子种类主要有2种: N+和Ar+。安徽省开展离子束介导转基因较早,多用Ar+作为注入离子。他们认为Ar+是一种惰性元素,不会与生物靶组织发生化学反应而沉积下来,最终以氩气的形式逸出靶面。卞坡等进一步研究表明,在相同的能量和剂量下,Ar+的刻蚀效果优于N+。但是,吴丽芳等研究认为,用相同剂量、相同能量的N+和Ar+处理小麦成熟胚,结果两种离子对小麦成熟胚出愈率的影响差异不显著。河南省在进行外源大分子DNA转移时,多用N+注入,其变异效果和三代的稳定情况并不比用Ar+ 的差。看来,拓宽离子束介导转基因所用的注入元素离子的种类,仍是今后研究的重点。
2. 2　注入离子的能量和剂量
注入离子的能量、剂量和脉冲剂量直接关系到离子束介导转化的效果。吴丽芳等研究认为,用离体小麦成熟胚为受体,以GUS基因(GFP基因)为供体,选用的离子注入能量在20～25 keV时,介导转基因效果较好。在能量为25 keV,脉冲剂量为2.6×1015 N+ /cm2 条件下,对小麦成熟胚进行处理,发现低剂量处理未导致出愈率降低,反而略有升高。然而,当剂量大于5 ×1016 ions/ cm2 时,会导致出愈率急剧下降。他们认为,选用4. 68 ×1016 ions/ cm2 作为离子束介导转基因的注入剂量较为合适。吴丽芳等在以外源大分子裸露DNA为供体,成熟种子胚为受体(不是离体胚)时,所用的照射能量为30 keV,剂量为7 ×1016 Ar+ /cm2。苌收伟等用俄罗斯制造的TITAN 全元素注入机,进行离子束辅助外源DNA转移时,所用的照射能量为30 keV,束流200mA,脉宽400ms,频率25 Hz,剂量为2 ×1017 N + / cm2。看来,不同的离子注入机在进行转基因操作时,要摸索合适的参数条件。
3　.离子束介导转基因程序
3. 1　受体前的处理
挑选成熟种子,进行消毒。首先用70%的乙醇表面消毒1 min,用无菌双蒸水冲洗干净,接着用0. 1%升汞浸泡15 min (或用20%次氯酸钠处理30 min) ,然后用无菌双蒸水冲洗干净, 用灭菌滤纸吸干水液。
3. 2　离子束注入处理
将灭菌后的种子,在无菌操作台上用手术刀将胚切下,胚朝上均匀摆放在平皿中。将无菌微环境靶室用酒精灭菌,放入平皿,种胚朝离子束方向,打开直通阀,接收离子束的刻蚀,待处理完后立即将种胚侵入含供体DNA (50μg/ml)的SSC导入介质中,温育1 h左右,取出种胚用SSC溶液反复冲洗3次,无菌滤纸吸干残存水液,接种到MS诱导愈伤培养基上。同时设2个对照,一个是种胚只放置在离子束注入的环境中,但不接受离子束注入处理,同样浸入含DNA的SSC介质中;另一对照是种子胚接受和处理相同的离子束处理,不含DNA的SSC溶液温育,两个对照的其它操作均相同。
3. 3　抗愈伤组织的筛选及植株再生
处理和两个对照在MS诱导愈伤培养基上预培养2天后,转入含潮酶素40 mg/L的相同培养基上,培养20天后将产生的小愈伤连同母体转入含潮酶素50mg/L的MS继代培养基上继续筛选,每2 周继代一次,约40天后,将得到的稳定抗50 mg/L 潮酶素的愈伤组织块,转入分化培养上进行植株再生。
3. 4　再生植株的分子检测
目前所报道的离子束介导的转基因植物,是用PCR和Southern来检测证明受体基因组是否含有目的基因片断。取再生植株的正常叶片,按卢扬江等介绍的方法提取并纯化植物DNA,以用作PCR分析。反应结束后,取扩增产物进行琼脂糖电泳。通过比较得到的扩增带和预期的片段的大小来证明供体基因是否存在于被测细胞中。取少量转基因植株的DNA酶切消化,然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离,按Southern的方法转移到尼龙膜上,用缺口转移法对酶切消化后分离得到的供体质粒DNA进行放射性同位素标记,并作为探针对转移的基因组DNA进行杂交和放射自显影分析。
3. 5　遗传学分析
将转基因植株连同对照(种子萌发苗)栽插到田间。种子分别收获脱粒后,取自交结实的转基因植物种子进行表面消毒后,在含潮酶素的MSO ( 50 mg/L)培养基上发芽,对照组在50 mg/L的培养基上完全受到抑制,且很快死亡。而转基因植株所获得的潮酶素抗性性状能够通过种子进行后代遗传。
4. 离子束介导转基因技术的突出优点
第一,刻蚀和溅射作用。荷能离子对生物材料具有极强的刻蚀和溅射作用,使细胞形成利于外源基因进入的可修复的微通道。
第二,射程的可控性和集束性。利于精确控制被处理组织细胞的刻蚀程度、损伤范围。
第三,静电作用。带正电离子注入细胞后,电荷交换使微通道积累正电荷,便于吸收带负电的外源DNA 主动进入细胞。
第四,离子注入造成靶细胞DNA链的损伤,受体细胞对损伤的DNA 的修复,利于外源DNA 与受体DNA的重组与整合。
第五,利用成熟种子的胚和愈伤组织作为外植体,便于取材和批量操作,同时也省去了原生质体制备和再生植株的麻烦,既方便又有效。
5.离子束介导转基因技术在农作物育种上的应用
水稻:离子束介导转基因这一技术首先在以水稻为受体的研究中得到了证实。余增亮等首次用离子束介导的方法将报告基因GUS和CAT导入水稻成熟胚和悬浮细胞。杨剑波等将携带有报告基因hph(潮酶素抗性基因)的质粒pBI222和GUS(β2葡萄苷酸酶基因)的pBI221分别导入水稻成熟胚和胚性悬浮细胞系中,获得了转基因水稻植株。在转化的悬浮细胞中,组织化学染色法检测到GUS的表达;而处理的成熟胚经潮霉素筛选得到3个稳定的抗性细胞系,并分化再生出32 株绿苗,其中移栽成活25 株,PCR扩增检测均得到与预期大小相同的350bp的扩增片段,进一步的Southern blot证实, hph基因整合到受体基因组中并稳定遗传。李红将水稻几丁质酶基因RCH8用此法转入多个水稻品种中,获得一批经PCR和Southern blot检测的转基因植株,转基因植株叶片的细胞粗提液表现出抑制被孢霉生长的作用。
最近,安徽省农科院抗菌肽shiva基因导入水稻恢复系明恢63熟胚中,经愈伤诱导和绿苗再生, PCR检测分析证明,外源基因已整合到再生植株的基因组中。通过离子束介导法将紫玉米的总DNA导入水稻品种早籼213,经连续6年12代的选育,获得了一批稳定遗传的变异株系,不仅根系发达,而且在茎干等部位表现出供体玉米的紫色性状。测定了其中农艺性状较好的8个株系的光合速率,平均比早籼213提高84%。用40个随机引物对上述8个玉米稻株系以及早籼213和紫玉米的基因组DNA 进行RAPD 分析,玉米稻DNA的RAPD扩增带和早籼213的相似性很高,但存在明显差异,出现来自玉米DNA的“目的带”,提示玉米DNA可能已经整合到受体的基因组中。
小麦:吴丽芳将水稻几丁质酶基因在氩离子介导下注入小麦,得到高效表达几丁质酶的小麦植株。在此基础上,将改良的绿色荧光蛋白基因(mGFP4)导入小麦栽培品种皖9210和皖麦32的成熟胚细胞。在含有100～120mg/L巴龙霉素培养基上继代培养后,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养,获得再生苗。对再生苗进行PCR 检测,均扩增出600bp的nptⅡ基因片段。取4株长势好的绿苗进行Southern杂交分析,结果表明,这4株绿苗皆为转基因植株。根据PCR分析结果统计,皖9210和皖麦32号的平均植株转化率分别是1.3%和4.1%。用同样的方法将水稻几丁质酶基因RCH8转入小麦品种皖9219和皖麦32的成熟胚中,经抗性筛选的再生植株当代(R0)及R1代均扩增出预期大小的DNA片段,Southern杂交证实外源基因已经整合到小麦基因组中；R1代叶片的细胞粗提液对小麦赤霉病菌株F 0和F15有明显的抑制作用,说明外源基因在受体中稳定遗传。
其他作物:日本原子能研究所于1998年用碳离子(大气环境中)介导将PCH基因转入干的花粉细胞。将基因转入花粉比转入裸露的细胞更加困难,因为花粉细胞为双层壁结构。同时,本实验首次尝试将束流引入室外,在大气环境中对生物材料进行注入。
此后,科学家们进一步深入研究,转移的外源基因也从以前的报告基因最终转向目的基因。卞坡等利用30KeV的离子束在1.5×1017ions/cm2的注入剂量下介导外源甘蓝全DNA导入模式植物拟南芥菜,在94株转化当代植株中,有6株表型产生变异。宋道军等以氯化钙制备感受态受体细胞转移法为对照,用离子束介导基因转移技术,将具有高效DNA损伤修复系统的耐辐射异常球菌(D.radiodurans)的基因组DNA片段转入对紫外(UV)辐照敏感的大肠杆菌中。
结果表明,转入DNA后的菌株对UV辐射的抗性不仅高于其对应的敏感菌株,而且也高于其对应的敏感菌株的产生菌株,表现为:转入DNA后的菌株受紫外辐照的存活率明显提高,代表修复合成的非按期DNA合成(UDS)能力大为增强。中国科学院等离子体物理研究所与安徽农业科学研究院合作,用粒子束介导法将紫色玉米全DNA转入水稻,获得了3个玉米稻新品系,在区域试验后将大范围推广。安徽农业大学用比克氏棉和红麻DNA转化泗棉2号,获得了高抗枯萎病的棉花新品系。在这些实验中,转移的外源DNA能够整合到受体基因组中,并能够在后代中稳定遗传。宋道军等将银杏DNA导入西瓜品种3～16和SR 221422中,银杏内酯在西瓜品种3～16和SR221422的转化当代叶片中的表达量分别为17.0756μg/g和45.9998μg/g;有银杏内酯表达的两个月龄西瓜叶片超氧化物岐化酶活性,也分别比对照提高了近一倍,表明获得了供体植物多基因在受体中的表达。离子束介导外源基因组DNA导入受体,可以筛选到带有目的性状的转化后代,为远缘和超远缘物种间遗传物质交流提供了一种新的有效途径,且可以实现多基因的转移和表达,显示出在农作物育种上的美好应用前景。
6.离子束介导转基因技术研究现状
从目前的研究现状来看,在利用低能离子束生物技术进行外源遗传物质的转化中,主要包括2个方面的研究内容,即低能离子束介导目的基因的遗传转化和离子束介导DNA大片段的遗传转化。大量的研究结果已经证实,低能离子束对生物体细胞的超微加工使得细胞的通透性会发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制,可以在细胞和组织上形成可修复的微孔,这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道。
经过近20年的不断研究和探索,在离子束介导转基因技术的发展过程中,离子束介导作用的异源遗传物质重组效应已经被越来越多的试验结果所证实,其实用性和普遍性也已经被相关领域的研究者所肯定,一些简单的生物学问题已经被阐明,一些实用性技术体系已经建立并不断得到完善。然而,离子束介导转基因技术在今后的发展中仍然面临着严峻的挑战,还有一些更引人注目的问题值得研究,今后在该领域内的研究难度会随着研究的不断深入而越来越大。此领域迫切需要建立一个更加完善的物理技术平台,急待形成一个更加完整的研究体系。有必要借助于其他学科的新技术或新工艺形成一个相互补充的技术集成体系,更应该将离子束介导转基因技术的实用性和普遍性的范围不断地拓宽。
7.问题与展望
虽然离子束介导转基因方法在外源遗传物质转移方面获得极大的成功,但这一新兴的技术还有待于进一步完善。从近10多年来离子束介导转基因技术的研究结果来看,学科内的研究资料尚缺乏系统性和完整性,即研究项目所涉及到的生物种类比较多,但对每一种生物的研究深度还比较肤浅;对某些生物物种内特定材料研究的比较多,而忽视了统一生物物种的不同基因型对离子束介导作用会表现不同的生物学效应；在通过离子束介导外源遗传物质对生物受体进行遗传改良的过程中,对其后代的表现型效应研究的比较多,而对其细胞学机理、生理生化基础和分子生物学机制的研究比较少。目前的装置需要在真空下进行离子注入,而真空的脱水作用和真空导致的冻害,使注入后细胞或组织的存活率大大下降。不仅严重影响转化的效率,而且限制了在动物和以无性繁殖为主的果木和蔬菜上的应用。对于不同的物种、不同基因型的材料,还需确定其适宜的转化参数。此外,国内进行离子注入所用的剂量单位是ions/ cm2 ,并非国际通用的计量单位,造成这一具有自主知识产权的新技术较难在国外优秀刊物上发表。改进装置,将离子束流引出真空是解决问题的关键,应建造一台能量更高、能引出外束的新装置。在目前条件下,为提高转基因效率和扩大受体范围,离子注入前用冷冻保护剂预处理是行之有效的方法。
由于低能离子束具有质荷能协同作用下的特殊生物学效应,它已在生物品种改良、生命起源和进化以及环境辐射生物学效应等多个理论和应用研究领域中获得长足发展。通过离子束介导外源基因转移已获得了一大批生物优良品系,取得了显著的社会经济效益,应用前景十分广阔。作为一门新的交叉学科,低能离子生物学将随着研究的不断深入,进一步完善其理论体系,拓展其应用研究领域,开创新的研究局面。可以预见,随着离子束生物技术的不断发展,离子束介导转基因技术将在更多的生物上得到应用,在外源基因组DNA转移方面取得突破性进展。知识创新工程为这一领域的发展提供了极好的机遇,相信在生物学家和物理学家的共同努力下,这一领域的发展前景将会更加广阔。
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