重组质粒的构建经验~~~.docx

重组质粒的构建经验~~~
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计pcr引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合dna片段上。如ndei就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的hindiii也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。ncoi4ndei6nhei3noti8pmei6saci3sali3smai3hindiii3bsti8sphi4xhoi3xbai3smai4案例分析一：本人最初曾选用ndei克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计pcr引物时，引入ndei酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在ndei序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择ndei和hindiii作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源dna片段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和dna片段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源dna片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒dna必须重新进行双酶切。实验案例分析2：本人曾用xhoi和hindiii酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现xhoi酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用kpni和hindiii构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑kpni酶失效。迁怒kpni，在我不知情下扔掉实验室所有kpni酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定hindiii位点失效。最后他责备本人暗中保留一手，没
有倾攮相授。呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵，你说冤不冤。这世道啊。也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“
一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。这里介绍一个估测处dna浓度的方法：dna可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：
1.取一平皿。
2.薄薄倒一层含有eb的琼脂糖胶，凝固（4℃可以存一个星期）。
3.平皿背面可以画成小方格。
4.一小格中点1ul样品。
5.另一小格格点1uldna标准品（我一般用takara2000dnalander，1ul相当60ng）6.凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。ok，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。
第二篇：基因重组质粒的构建与抽提基因重组质粒的构建与抽提
摘要....................................................................................................................................................Ⅰabstract............................................................................................................................................Ⅱ引言.......................................................................................................................................................11材料与仪器、用品.........................................................................................................................22原理与方法......................................................................................................................................3
2.1获取目的基因.......................................................................................................................3
2.1.1提取rna.................................................................................................................32.1.2rna反转录为cdna............................................................................................32.1.3聚合酶链式反应......................................................................................................42.2回收目的基因.......................................................................................................................5
2.2.1核酸电泳....................................................................................................................52.2.2胶回收........................................................................................................................62.3dna分子体外连接.............................................................................................................72.4转化.......................................................................................................................................72.5抽提鉴定质粒.......................................................................................................................83讨论...............................................................................................................................................103.1试剂.....................................................................................................................................113.2核酸酶................................................................................................................................113.3核酸电泳缓冲液...............................................................................................................113.4胶回收效率........................................................................................................................113.5dna酶切位点..................................................................................................................113.6转化效率............................................................................................................................113.7试剂盒................................................................................................................................12参考文献...........................................................................................................................................13致谢....................................................................................................................错误。未定义书签。附录....................................................................................................................................................14
contentschineseabstract............................................................................................................................Ⅰabstract.........................................................................................................................................Ⅱpreface.............................................................................................................................................11materialsandequipment，supplies...............................................................................................22theprincipleandmethod.............................................................................................................22.1acquiretargetgene...............................................................................................................22.1.1extractionofrna........................................................................................................22.1.2rnatranscriptionforcdna.........................................................................................32.1.3polymerasechainreaction..............................................................................................32.2recyclingtargetgene............................................................................................................52.2.1nucleicacidelectrophoresis...........................................................................................52.2.2plasticrecycling.............................................................................................................42.3connectionofdnamoleculesinvitro.................................................................................52.4transformation......................................................................................................................
52.5extractionandidentificationofplasmid...............................................................................63disguss.......................................................................................................................................10
3.1reagent................................................................................................................................11
3.2nuclease..............................................................................................................................11
3.3thenucleicacidelectrophoresisbuffer...............................................................................11
3.4efficiencyofplasticrecycling.............................................................................................11
3.5dnaenzymeloci................................................................................................................11
3.6theefficiencyofconversion...............................................................................................11
3.7kit........................................................................................................................................12references.....................................................................................................................................10acknowledgement.........................................................................................................................10appendix.......................................................................................................................................10
引言
自噬是一种实现细胞本身代谢需要和某些细胞器更新的生命活动，该活动对于动物机体生长发育具有重要意义。自噬相关基因lc3通过与细菌质粒结合可以大量复制。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状dna分子。不同微管之间的差异，主要与结合于微管的非微管结构蛋白有关，它们参与微管结构的组装，维持微管的稳定lc3和微管与其他骨架纤维之间的连接，表现为广泛的功能性作用，该类蛋白被统称为微管相关蛋白，lc3即微管相关蛋白轻链3，作为动物机体的一个自噬相关基因，对于其自噬活动相关微管蛋白质表达具有重要意义，目前国内外对该基因研究逐步增多、不断深入。vega-naredo等研究表明lc3调控对巨噬过程是至关重要的，因为蛋白质lc3-ii定位自噬前体和自噬小体，它被认为是一个自噬标记，在其对两性哈德氏腺的实验中，免疫印迹分析显示了lc3-i和lc3-ii两个对应波段[1]；hanqingdong等的发现表明，lc3结合可能发生在脂滴表面，导致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候选识别是脂滴-相关蛋白质；noborumizushima和masaakikomatsu的文章叙述了选择性自噬最有特性的基质是p62，它也被称为死骨片1/sqstm1，p62是广泛表达的细胞蛋白质，在动物中守恒，但在植物和真菌不是，在分隔膜中通过lc3-作用区域p62直接与lc3相互作用[3]。此次实习实验过程中，将该基因作为目的基因，采用基因克隆技术构建重组基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成为相关研究、实验的组成环节，例如用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学检验，以及动物机体蛋白质表达控制研究、自噬研究等。
质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区dna原有的能够自主复制的较小的dna分子，即细胞附殖粒、又称胞附殖粒。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中，总体多为原核生物。构建重组质粒指将目的基因，即外源基因，与具有自主复制能力的载体在体外人工连接，构建成新的重组dna，随后抽提质粒可以将目的基因与细菌dna分离，以获得高纯度的目的基因。笔者通过实验学习、实际动手操作，完成了此质粒的构建和抽提过程，并在文中阐述了获取目的基因后而进行的lc3基因克隆过程，其中使用gfp、rfp载体构建质粒。基因克隆又称为分子克隆，指采用重组dna技术，将不同来源的dna分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合dna分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子的过程。其是七十年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可简要叙述为分、切、连、转、选五个步骤。其最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制，即把一段外源dna片段与质粒dna连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入细菌中，建立基因克隆体系。本实验构建含gfp-rfp-lc3基因的重组质粒，gfp、rfp分别为绿色和红色荧光基因；使用的t载体为克隆载体，符合基因工程的载体应具有的基本性质，包括在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，使外源重组的dna片段得以扩增；分子量小，利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源dna片段，且在实验操作中也不易被机械剪切而破
[2]
坏；载体分子中具有两个以上的容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞的不同表型特征；载体具有较多的限制酶单一切点，为避开外源dna片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
细胞中的rna可分为信使rna、转运rna和核糖体rna三大类，不同组织总rna提取实质就是将细胞裂解，释放出rna，并通过不同方式去除蛋白、dna等杂质，最终获得高纯rna产物的过程，目前，国内外提取rna的技术均比较成熟，生产出的有关试剂盒利用分子量比较大的有机溶剂氯仿使有机相和无机相迅速分离，初步获取rna，并进一步分离纯化。提取rna后将其反转录并扩增，即可获得用于重组质粒的目的基因。重组质粒过程中利用了聚合酶链式反应（pcr）、琼脂糖凝胶电泳等方法。聚合酶链式反应是利用dna片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异dna片段的技术，它应用热稳定的聚合酶，通过双链dna模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，dna片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的dna甚至单个细胞所含有的dna起始，可产生微克量的pcr产物。琼脂糖凝胶电泳以琼脂凝胶作为支持物，利用核酸分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。重组质粒构建后，使用axyprep质粒dna小量试剂盒抽提质粒，本实验采取的离心法抽提质粒，即去除rna，将质粒与细菌基因组dna分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最后将得到的质粒送至有关生物公司测序，测序结果分析表明，目的基因片段存在于送检样品中，说明实验成功构建并获取了鸭rfp-gfp-lc3重组质粒。
1材料与仪器、用品
鸭肝脏组织，液氮，75%酒精，无水乙醇，氯仿，蒸馏水，普通双蒸水，琼脂糖，50倍浓度商品化tae，2000bpdna标准参照物（marker），填充剂（loading），氨苄霉素，lb培养液，e.colidh5a菌株。
美国omegarna提取试剂盒，包含hibin微型制备管，2毫升收集管，rna-solv试剂，rnawash缓冲液i，rnawash缓冲液ii，depc水等。
axyprep质粒dna小量试剂盒，试剂盒中的试剂包括小量制备制备管，2毫升微量离心管，
1.5毫升微量离心管，rna酶a，缓冲液s1，缓冲液s2，缓冲液s3，缓冲液w1，缓冲液w2浓缩液，eluent洗脱液。
axyprepdna凝胶回收试剂盒，试剂盒中试剂包括缓冲液w1，缓冲液w2浓缩液，缓冲液de-a，缓冲液de-b，eluent洗脱液。
rna引物混合液，包含模版rna，随机引物，无rna酶双蒸水等。
反转录反应液，包含模版rna引物变性溶液，随机引物，5倍浓度m-mlv缓冲液，dntp混合物，rna酶抑制剂，rna酶m-mlv，无rna酶双蒸水。
一次性口罩，一次性手套，实验工作服，超净工作台，恒温培养箱，制冰机，研钵，移液器，枪头，无dna酶和rna酶的收集管，
1.5毫升收集管，2毫升收集管，制备管，离心机，恒温水浴锅，振荡器，冰盒，酒精灯，蒸馏设备和用品（50毫升烧杯，蒸馏头，100℃温度计，冷凝管，接引管，三角瓶，铁夹，铁环，酒精灯，沸石，50m量筒，铁架台），
pe管，pcr仪，锥形瓶，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，电泳仪电源，记号笔，卫生纸，玻璃涂棒。
2原理与方法
2.1获取目的基因2.1.1提取rnarna提取的原理就是将细胞破碎裂解，利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和dna的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终得到纯净的rna的过程。影响rna提取质量的因素有很多，尤其是rna酶的污染。rna酶无处不在，包括破碎细胞内的rna酶，实验室空气、实验台上的酶，实验所用试剂中的酶，实验人员身上携带的酶以及实验器材的污染等等，而且rna酶性质稳定，实验室很难做到完全隔离这个酶的作用[4]。rna提取试剂盒的通病就是a260/a230普遍偏低，主要是因为rna样品中易残留rna酶的变性剂异硫氰酸胍和β-巯基乙醇，细胞裂解不彻底，导致核糖核酸不能完全释放出来。另外，有些细菌的细胞壁坚韧，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。
本实验使用美国omegarna提取试剂盒。实验前，酒精充分消毒实验台、实验室空气，戴棉手套取适量液氮置于保温瓶中，将用酒精冲洗过的研钵泡入液氮中，同时将鸭的肝组织泡入液氮中，待两者充分冷冻，在研钵中研碎鸭肝组织。
操作步骤包括取适量组织粉末置于无dna酶和rna酶的收集管中，离心，5000转/分钟，5分钟，4℃。加1毫升rna-solv试剂，振荡混匀，室温孵化3分钟。加0.2毫升氯仿（每1毫升rna-solv与组织混合液加0.2毫升氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，冰上孵育10分钟。随后4°c，12000转/分钟，离心10分钟，离心后混合物分三层，rna存在于最上层水相。将五分之四的rna水层置于新的收集管，加三分之一收集管的无水乙醇。轻微混匀并离心后，小心吸出不大于700微升的上层rna水层液体于无rna酶的制备管中，振荡混匀沉淀，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。重复上一步骤，再次离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。将制备管置于新的2毫升收集管，加400微升rnawash缓冲液i，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。用同一收集管，加500微升rnawash缓冲液ii，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液，随后用空收集管离心，13000转/分钟，2分钟，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于超净台上晾5分钟；或将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50°c烘箱中放置3分钟。最后洗提rna，将制备管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的depc水，确保加入到制备管中央，随后室温静置2分钟，离心，13000转/分钟，1分钟，20℃。得到的rna保存在超低温冰箱。
2.1.2rna反转录为cdna反转录是以rna为模板，通过反转录酶催化，以dntp为原料，合成dna的过程，是dna
生物合成的一种特殊方式。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖rna的dna聚合酶，即以rna为模板催化dna链的合成，合成的dna链称为与rna互补dna（cdna）。反转录酶的作用是以dntp为底物，以rna为模板，trna（主要是色氨酸trna）为引物，在trna3′末端上，按磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向方向，合成一条与rna模板互补的dna单链，这条dna单链叫做互补dna，它与rna模板形成rna-dna杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉rna链，再以cdna为模板合成第二条dna链。至此，完成由rna指导的dna合成过程[
6、7]。
操作步骤包括收集管中配制模版rna引物混合液，为6微升体系，包含模版rna2微升，随机引物1微升，无rna酶双蒸水3微升。70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。离心数秒种使模版rna引物的变性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反转录反应液，为10微升体系，包含上述模版rna引物变性溶液6微升，随机引物1微升，5倍浓度m-mlv缓冲液2微升，dntp混合物0.5微升，rna酶抑制剂0.25微升，rna酶m-mlv0.5微升，无rna酶双蒸水0.75微升。因为本实验使用随机引物，所以先于30℃恒温水浴锅保温10分钟，然后42℃保温60分钟。70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cdna做好标记并保存于超低温冰箱。
2.1.3聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（pcr）是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，它的最大特点，是能将微量的dna大幅增加[8]。聚合酶链式反应是利用dna在体外95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60°c左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度（72°c左右），dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制以得到多量脱氧核糖核酸[
9、10]。
本实验第一次聚合酶链式反应是用两对引物分别扩增cdna为dna，目的是判断哪一对引物扩增效果好，选择其进行dna扩增。准备步骤包括制作双蒸水，首先取蒸馏水200微升，于超净台点燃酒精灯，安装设备对蒸馏水再次蒸馏，pe管分装后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭双手，禁用双手触碰pe管口。rna引物获取，是将目的基因送至博士生物公司，由其进行引物的设计与合成；合成的引物经过真空冷冻干燥，呈薄膜状附在离心管中，盛有引物的离心管经过离心后开启，随后加入规定量的双蒸水合上管盖充分振荡使其溶解，备用。
操作步骤包括准备四个pe管，并分别标记为1-
1、1-
2、2-
1、2-2，将两对引物分别加入两个模版中，配制25微升体系，每管加入r-tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dntp1微升，模版3微升，双蒸水11微升。将所有pe管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留混合液，随后摆到双面板上；使用pcr扩增仪进行rna扩增，打开电源开关，设置运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟，72℃、10分钟，4℃、保存时长，循环30次。
2.2回收目的基因
2.2.1核酸电泳
核酸电泳，其中利用了琼脂糖凝胶，琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度[11]。将凝胶置电场中，在中性ph值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同